内质网应激介导的胰岛β细胞凋亡研究进展

胰岛β细胞具有十分发达的内质网(ER),并且对应激非常敏感。多种原因都会使ER的稳态被破坏,引起未折叠蛋白反应(UPR)以及Ca^2+稳态失衡,进一步诱发内质网应激(ERS)。适度的ERS有利于恢复其稳态,过度的ERS会导致ER功能受损,并进一步诱导胰岛β细胞凋亡,从而介导糖尿病的发生、发展。因此,对生理及病理条件引发的ERS进行分析,探讨ERS介导的胰岛β细胞凋亡,可为糖尿病的深入研究奠定理论基础。     

内质网应激诱导的生存与凋亡机制

内质网是细胞内重要的细胞器。未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网内的大量堆积能够引起内质网应激反应(ERS)。内质网通过激活未折叠蛋白反应(UPR),暂停早期蛋白质的合成,减少未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网内的聚集,从而恢复细胞的正常生理功能,保护细胞。但如果内质网应激反应持续进行或无法缓解,则会引起促凋亡因子的产生,最终导致细胞凋亡。     

肠上皮细胞中内质网应激与动物肠道炎症机制的研究进展

近年来,内质网应激参与动物炎症性肠病发病机制的研究引起了广泛关注,未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔中过量积累而引发内质网应激,持续的内质网应激则会导致动物肠黏膜屏障损伤并诱发肠道炎症。本文就内质网应激发生机制、未折叠蛋白质反应及内质网应激与肠道炎症互作机制进行了综述,旨在为防治动物肠道炎症提出新的治疗策略。     

CHOP调控内质网应激介导细胞凋亡的机制

C/EBP同源蛋白CHOP是一种29K的细胞蛋白,主要参与调控细胞增殖、分化以及能量代谢等。CHOP作为转录因子在内质网应激(ER Stress,ERS)介导的细胞凋亡中起重要作用。ERS通常是指ER中错误折叠或未折叠蛋白质增加引起的应激反应。发生ERS时,细胞会通过未折叠蛋白反应(UPR)维持细胞内稳态。长期或过度的应激会导致ER功能障碍和凋亡发生。ER通过3个主要途径诱导细胞凋亡,包括IRE1/ASK1/JNK途径、Caspase-12 激酶途径和CHOP途径。     

白藜芦醇对热应激诱导的山羊小肠上皮细胞炎性反应调节作用的研究

本试验旨在探究白藜芦醇对热应激（HS）诱导的山羊小肠上皮细胞炎性因子转录的影响。采用生长良好的第4代山羊小肠上皮细胞（GIE细胞）,分为空白对照组（37℃）、热应激组（42℃）、42℃热应激加白藜芦醇组（5、15、30 μmol·L^-1）;加药预处理6 h后进行热应激处理6 h。通过CCK-8法检测白藜芦醇细胞毒性;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白藜芦醇对热应激诱导的细胞因子分泌的影响;采用生化法检测白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞抗氧化性能的影响;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞HSP70、IL-1β、TNF-α、IL-8和NF-κB基因转录的影响。结果显示：不同浓度（5、15、30 μmol·L^-1）的白藜芦醇可不同程度地提高热应激诱导的GIE细胞GSH-Px、SOD及T-AOC活性,极显著降低脂质过氧化物MDA含量（P<0.01）;不同浓度（5、15、30 μmol·L^-1）的白藜芦醇能不同程度地抑制热应激诱导的GIE细胞IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌,并极显著降低炎性模型细胞IL-1β、TNF-α、IL-8、HSP70和NF-κB的基因转录水平（P<0.01）。结果提示,白藜芦醇可调节热应激诱导GIE细胞炎性模型中HSP70基因表达和炎症因子的产生及表达,促进抗氧化酶活力,具有显著的抗炎活性,其抑炎作用可能与抑制NF-κB信号通路相关。     

NFκB-Orai1参与NEFA诱导的内质网应激

为探究NFκB-Orai1是否参与游离脂肪酸(NEFA)诱导的内质网应激,首先通过体外添加一定浓度的非酯化脂肪酸(nonestesterifiedfatty acid,NEFAs)(1.2 mmol/L)处理大鼠肝细胞不同时间,运用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,测定NEFAs对内质网应激(ER stress)标志分子GRP78表达量以及钙通道相关蛋白Orai1表达水平的影响。结果显示NEFAs处理12 h时GRP78、Orai1表达量极显著高于对照组(P0.01),证明12 h NEFAs刺激诱导产生内质网应激效果最佳。而后又通过分别添加NFκB抑制剂wogonin与Orai1抑制剂2APB,结果显示抑制NFκB和Orai1后NEFAs刺激可明显降低GRP78、NFκB p65、Orai1的表达水平。结果表明NFκB-Orai1参与NEFA诱导的内质网应激。     

伪狂犬病毒感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激和未折叠蛋白反应的影响

【目的】探讨伪狂犬病毒(PRV)感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激及未折叠蛋白反应(UPR)的影响。【方法】将悬浮的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)以感染复数(MOI)0.01接种PRV,分别在接毒后12、24、36、48和56 h取样,用CCK-8法检测细胞存活率,按Reed-Muench法检测病毒滴度,筛选病毒接种处理的合适时间;以不接毒细胞作对照组,分别在感染后12、24、36和48 h取样,用实时荧光定量PCR法检测内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及UPR的3种感受蛋白(PERK、IRE1、ATF6)相关通路中基因的表达变化,Western blotting法检测相关蛋白的表达变化。在接种PRV同时分别加入0、0.001、0.005、0.01和0.02 μmol/L内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(Tg)和0、20、40、80和160 μmol/L内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA),48 h收集细胞测定病毒滴度和细胞存活率。【结果】PRV感染56 h细胞存活率低于70%,感染48 h时病毒滴度达到最高(8.1 lg TCID₅₀/mL),因此后续试验分别在接毒后12、24、36和48 h取样。与对照组相比,PRV感染36和48 h GRP78转录水平均极显著升高(P＜0.01);PERK通路中,转录激活因子4(ATF4)转录水平在PRV感染36、48 h均极显著升高(P＜0.01),生长抑制DNA损伤基因34(GADD34)转录水平在PRV感染36 h显著升高(P＜0.05)、48 h极显著升高(P＜0.01),磷酸化真核翻译起始因子(P-eIF2α)蛋白水平在PRV感染36、48 h均极显著升高(P＜0.01);IRE1通路中,PRV感染组细胞36 h后多以剪切形式sXBP1存在,同时下游p58^IPKmRNA水平在36 h显著增加(P＜0.05),p58^IPK和EDEM mRNA水平在48 h均极显著增加(P＜0.01);ATF6通路中,PRV感染不同时间ERp57、PDI、Calnexin和Calreticulin的表达均无显著变化(P＞0.05)。与0 μmol/L组相比,0.01和0.02 μmol/L Tg极显著降低细胞存活率(P＜0.01),0.005和0.01 μmol/L Tg均极显著增加了PRV病毒滴度(P＜0.01)。【结论】PRV感染可以诱导BHK-21悬浮细胞内质网应激,激活UPR的PERK和IRE1信号通路,说明PRV利用内质网应激增强其复制。     

β-羟基丁酸通过激活TLR4/NF-κB通路诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应

旨在探究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)通路在β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHBA)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的分子作用机制。通过添加不同浓度的BHBA诱导奶牛乳腺上皮细胞MAC-T以模拟奶牛高酮血症中乳腺上皮细胞的炎性反应,并利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染细胞42 h后加入3.6 mmol/L BHBA再处理24 h;通过RT-qPCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)和IL-6等炎性因子的表达变化,并采用Western blot法测定TLR4/NF-κB通路关键蛋白的相对表达水平。结果表明,与对照组相比,不同浓度BHBA处理后,乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高,当BHBA浓度为1.2 mmol/L或以上时,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值和TRAF6蛋白水平显...     

围产期奶牛乳腺内质网应激的研究进展

围产期是奶牛的一个应激时期,内质网应激作为细胞对不利刺激的适应性反应,存在于围产期奶牛乳腺中。本文围绕围产期奶牛乳腺组织中的内质网应激进行综述,阐述了内质网应激影响奶牛乳腺泌乳的机制,并从能量负平衡、钙稳态失衡、氧化应激、疾病因素几个方面分析了可能导致乳腺发生内质网应激的原因,以期为围产期奶牛乳腺的健康调控提供指导。     

抑制内质网应激保护心肌缺血再灌注损伤的药物研究进展

目的:介绍药物防治心肌缺血再灌注损伤方面的研究进展。方法:根据近几年的研究文献,总结药物防治心从缺血再灌注损伤方面的研究进展。结果:4-苯基丁酸、柚皮素、绞股蓝皂苷、黄连素有良好的抗心肌缺血再灌注损伤作用。作用机理包括:抗氧化应激、抗内质网应激等。结论:药物可以通过抑制内质网应激保护缺血心肌。     

BCG感染巨噬细胞后内质网应激对细胞焦亡的调控作用

旨在探讨牛分枝杆菌疫苗株卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）感染人单核巨噬细胞THP-1细胞后内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）对细胞焦亡的调控作用及分子机制。在BCG单独感染THP-1细胞或与ERS抑制剂TUDCA共处理细胞后,采用qRT-PCR检测ERS标志性分子GRP78,细胞焦亡标志性分子GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL-1β和IL-18在mRNA水平的表达,采用Western blot检测GRP78、Caspase12、GSDMD、Caspase1和NLRP3在蛋白水平的表达,采用ELISA检测IL-1β和IL-18的释放量,采用CCK-8检测细胞存活率。结果表明：在BCG单独感染THP-1细胞不同时间后,GRP78在mRNA水平和蛋白水平的表达均随感染时间延长而升高（P<0.01）,GSDMD蛋白表达在24 h达到最高,IL-1β和IL-18在mRNA水平的表达呈时间依赖性（P<0.01）。在BCG单独感染或与TUDCA共同作用细胞24 h后,与未感染对照组相比,BCG感染组GRP78、GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL-1β和IL-18 mRNA水平表达上调（P<0.05）,GRP78、Caspase12、GSDMD、Caspase1和NLRP3蛋白水平表达上调（P<0.001）,IL-1β和IL-18的浓度增加（P<0.01）,细胞存活率下降（P<0.001）,而经TUDCA预处理的BCG感染组与BCG单独感染组相比,以上分子的表达下降,细胞存活率上升（P<0.01）。综上表明,在BCG感染THP-1细胞后,引起的ERS对细胞焦亡具有调控作用。     

内质网应激和氧化应激在纳米氧化铈所致肺损伤中的作用

观察不同剂量纳米氧化铈颗粒染毒后对大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的影响及大鼠肺组织GRP78蛋白表达情况,探讨其导致肺损伤的作用机制。将粒径为35nm±3nm的纳米氧化铈颗粒悬液以不同剂量(100mg/kg、400mg/kg)给大鼠气管滴注,染毒28d后,测定大鼠血清中SOD活力、MDA含量及肺组织GRP78蛋白表达情况。与对照组相比,高低剂量纳米氧化铈染毒组大鼠血清中SOD活力及MDA含量均无明显改变(P0.05),GRP78蛋白表达均显著增高(P0.05)。纳米氧化铈染毒大鼠所致肺损伤与内质网应激有关,与氧化应激的关系有待进一步研究。     

猪肝星状细胞内质网应激模型的建立及对泛素化的影响

试验对衣霉素（tunicamycin,TM）处理猪肝星状细胞的浓度和培养时间进行筛选,以期成功构建内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）模型,并在此基础上探究ERS下猪肝星状细胞泛素化的变化。试验采用浓度为0、1、2、5、10和15 μg/mL的TM处理猪肝星状细胞,培养2、4、8、16、24和36 h。通过检测细胞抑制率对TM浓度和培养时间进行初筛;通过检测细胞周期及ERS标志基因和蛋白表达对TM浓度和培养时间进行终选,以确定是否成功构建ERS模型,同时,在ERS下检测猪肝星状细胞泛素化相关基因的表达变化。结果表明：由细胞抑制率检测结果初步确定TM浓度5 μg/mL、培养8或24 h后有可能出现ERS。5 μg/mL TM在培养8或24 h时,ERS标志基因表达均极显著上调（P < 0.01）。在培养8 h时,ERS标志蛋白中仅ATF4显著上调（P < 0.05）,细胞周期中仅G2/M期细胞比例显著下降（P < 0.05）;在培养24 h时,ERS标志蛋白均显著上调（P < 0.05）,细胞周期在G1期出现阻滞,并导致S期和G2/M期细胞比例极显著下降（P < 0.01）。以上结果说明,5 μg/mL TM培养24 h可成功构建细胞ERS模型。在ERS下,细胞泛素化相关基因UBA2和UBE2E的表达均极显著升高（P < 0.01）。综上,猪肝星状细胞经5 μg/mL TM处理24 h,可成功建立ERS模型,并启动泛素化机制。     

牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响

旨在研究牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统(T4SS)对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响,深入探究布鲁氏菌的分子致病机制.本研究以牛种布鲁氏菌疫苗株A19及其T4SS启动子缺失株A19ΔVirB侵染小鼠巨噬细胞,分别在侵染的6、12、24 h收集细胞RNA和总蛋白,通过qRT-PCR以及Western blot检测内质网应激标...     

富氢生理盐水干预小型猪肝脏缺血再灌注合并肝脏部分切除损伤中内质网应激影响的研究

为探究富氢生理盐水（hydrogen-rich saline,HRS）干预小型猪肝脏缺血再灌注合并肝脏部分切除损伤中内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）影响,试验选取4~6月龄、体重20~30 kg的健康巴马小型猪18头,随机分为3组,每组6只,分别为假手术组、模型组和HRS干预组。假手术组仅进行翻动肝叶,维持气腹3 h;模型组用腹腔镜手术建立右半肝脏缺血60 min合并左半肝脏切除模型;HRS干预组建立手术模型并于门静脉置管在再灌注前10 min及术后1、2、3 d经静脉注射10 mL/kg HRS。各组分别于术前、再灌注即刻、术后即刻、术后1 d、术后3 d经腹腔镜手术采取肝脏组织,进行HE染色检测,并检测肝脏组织中ERS参数：PKR样ER调节激酶（PERK）、需肌醇酶1（IRE1）、活化转录因子6（ATF6）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、活化转录因子4（ATF4）、C/EBP转录因子（CHOP）mRNA的表达水平。结果显示,模型组、HRS干预组肝脏组织病理变化较假手术组严重,且与假手术组相比,模型组、HRS干预组ERS相关参数mRNA表达水平上调;HRS干预组肝脏组织病理变化较模型组轻微,且各项ERS相关参数mRNA表达水平均低于模型组。结果表明,缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）能诱导肝脏ERS,导致肝脏损伤,而HRS可能是通过抑制过度的ERS从而减轻肝脏IRI。     

内质网应激标记基因Grp78参与鹅肥肝免疫/炎症状态的调控

旨在揭示内质网应激(ERS)标记基因Grp78是否参与鹅肥肝中炎症/免疫相关基因的表达调控。本试验选择健康的、体重相近的70日龄朗德鹅30只(未分公母),随机分为对照组(n=15)和填饲组(n=15)。利用荧光定量PCR测定不同填饲阶段(填饲7、14、19 d)不同组织中Grp78的相对表达量(n=4),以明晰Grp78与鹅肥肝形成的关联;在鹅原代肝细胞中过表达Grp78,并通过RNA-seq分析Grp78所影响的信号通路和基因(n=3);利用荧光定量PCR检测鹅肥肝中与炎症/免疫相关的基因表达量(n=4),以明晰这些基因与Grp78的关联。结果表明,肝和腹脂中Grp78的表达量受填饲影响(肝中下降,而腹脂中上升)。Grp78基因的过表达试验表明,ERS除了可影响已知的代谢病和细胞凋亡通路外,还影响信号转导、免疫等通路。在免疫/炎症方面,"Toll-like receptor signaling pathway"、"TNFαsignaling pathway"、"NF-kappa B signaling pathway"等通路最为突出。此外,免疫/炎症相关基因Tnfsf10、Map3k7cl在鹅原代细胞中的表达受Grp78过表达影响,在鹅肥肝中受填饲影响。总之,本研究揭示了Grp78/ERS新的生物学功能,即对细胞的免疫/炎症状态进行调控,并借此参与鹅肥肝的形成。     

犬脂肪来源间充质干细胞对重症急性胰腺炎体外内质网应激模型的抗凋亡作用

【目的】 探究犬脂肪组织来源的间充质干细胞(cAd-MSCs)对重症急性胰腺炎(SAP)体外模型的抗凋亡作用,以期为利用干细胞治疗胰腺炎提供理论指导。【方法】 ①用Ⅰ型胶原酶消化分离cAd-MSCs,用流式细胞术鉴定其干细胞标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73和CD90的表达,用成脂、成骨和成软骨分化来鉴定其多向分化潜能;②用Ⅰ型胶原酶从小鼠胰腺组织中分离胰腺腺泡细胞(PACs),用实时荧光定量PCR检测PACs及胰腺组织中胰腺导管特异性基因CK19、β-胰岛细胞特异性细胞基因Insulin-1、α-胰岛细胞特异性基因Glucagon及PAC特异性基因PTF-1α、CPA-1、AMY2B的表达;③以10、20 μg/mL脂多糖(LPS),10、100 mmol/L雨蛙肽(Caerulein)以及10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein处理PACs,不添加药物培养的细胞为对照组,培养24 h后使用CCK-8检测PACs存活率,筛选体外构建内质网应激模型的最佳处理组(即模型组,P);用CCK-8检测对照组(Naive)及模型组(P)细胞0、2、4、8、12和24 h的存活率,Western blotting检测P组细胞内质网应激相关蛋白的相对表达量;④为确定cAd-MSCs对PACs的作用方式,试验分为PAC组(仅PACs,Naive)、P组、间接共培养组(IC)、直接共培养组(构建PAC模型时与cAd-MSCs直接共培养,DC),用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF-α)基因在PACs中的表达水平;⑤在间接共培养系统中,将细胞分为空白对照组(仅PACs,Naive)、对照组(PACs与cAd-MSCs共培养,C)、P组及试验组(药物处理的PACs与cAd-MSCs细胞共培养,T),细胞培养12 h后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting检测各组细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平的变化,并用TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。【结果】 ①分离培养的cAd-MSCs呈现成纤维样细胞形态,高表达干细胞标志物CD29、CD44、CD73及CD90,不表达CD34和CD45,且具备成脂、成骨、成软骨分化能力;②分离的原代PACs呈鹅卵石样,与胰腺组织相比较,AMY2B、CPA1、PTF1α基因的相对表达量均显著增加(P<0.05),CK19、Glucagon、Insulin-1基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。③与对照组相比,10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein组细胞存活率极显著降低(P<0.01),因此选为构建内质网应激模型的最佳处理组。与对照组相比,4 h时P组PACs的细胞存活率显著降低(P<0.05),8、12、24 h均极显著降低(P<0.01);Western blotting检测结果显示,Grp78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达水平自4 h开始均极显著增加(P<0.01)。④与Naive组相比,P组TNF-α基因的表达水平极显著增加(P<0.01);与P组相比,IC和DC组TNF-α基因表达水平均极显著降低(P<0.01),后续用间接共培养系统进行试验。⑤在间接共培养系统中,与P组相比,T组Grp78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。TUNEL检测结果显示,T组阳性细胞数明显减少。【结论】 本试验成功构建SAP体外内质网应激模型,且证明cAd-MSCs对PACs内质网应激具有调控及保护作用。     

Molecular insights into the mechanisms of liver‐associated diseases in early‐lactating dairy cows: hypothetical role of endoplasmic reticulum stress

The transition period represents the most critical period in the productive life of high‐yielding dairy cows due to both metabolic and inflammatory stimuli, which challenge the liver and predispose dairy cows to develop liver‐associated diseases such as fatty liver and ketosis. Despite the fact that all high‐yielding dairy cows are affected by marked metabolic stress due to a severe negative energy balance (NEB) during early lactation, not all cows develop liver‐associated diseases. Although the reason for this is largely unknown, this indicates that the capacity of the liver to cope with metabolic and inflammatory challenges varies between individual high‐yielding dairy cows. Convincing evidence exists that endoplasmic reticulum (ER) stress plays a key role in the development of fatty liver, and it has been recently shown that ER stress occurs in the liver of high‐yielding dairy cows. This indicates that ER stress may be involved in the development of liver‐associated diseases in dairy cows. The present review shows that the liver of dairy cows during early lactation is exposed to several metabolic and inflammatory challenges, such as non‐esterified fatty acids, tumour necrosis factor α, interleukin‐1β, reactive oxygen species and lipopolysaccharides, which are known inducers of ER stress. Thus, ER stress may represent a molecular basis for fatty liver development and account for the frequent occurrence of fatty liver and ketosis in high‐yielding dairy cows. Interindividual differences between dairy cows in the activation of hepatic stress response pathways, such as nuclear factor E2‐related factor 2, which is activated during ER stress and reduces the sensitivity of tissues to oxidative and inflammatory damage, might provide an explanation at the molecular level for differences in the capacity to cope with pathological inflammatory challenges during early lactation and the susceptibility to develop liver‐associated diseases between early‐lactating dairy cows with similar NEB and milk yield.