永生化犬骨髓间充质干细胞株的建立

为了建立永生化的犬骨髓间充质干细胞(cBMSCs)株,为其在基础研究方面的应用创造方便快捷的途径,本试验将构建好的pLOX-Ttag-iresTK慢病毒载体包装后感染cBMSCs,连续培养传至50代,通过细胞形态观察、细胞计数、RT-qPCR基因表达分析、Western blot、流式细胞术以及三系分化鉴定永生化cBM...     

骨髓间充质干细胞移植对帕金森病模型大鼠纹状体多巴胺水平的影响

旨在探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对帕金森病(PD)模型大鼠纹状体内多巴胺(DA)水平的影响。选取正常大鼠(N组),造模后4周、8周PD大鼠(M4、M8组),BMSCs移植治疗4周、8周后PD大鼠(T4、T8组)纹状体匀浆液,以高效液相色谱(HPLC)法检测各组纹状体内DA的含量。结果表明,N组大鼠纹状体内DA的含量为(15.56±2.16)μg/g;M4和M8组大鼠损毁侧脑纹状体内DA含量为(10.67±1.54)μg/g和(10.50±2.32)μg/g,均显著低于N组(P0.05);T4和T8组大鼠损毁侧纹状体内DA含量为(12.70±2.91)μg/g和(13.71±2.42)μg/g,均显著高于M4和M8组(P0.05)。T8组DA含量显著高于T4组(P0.05),表现出随细胞移植时间的延长DA水平逐渐恢复的规律。说明BMSCs移植提高了PD模型大鼠脑纹状体内DA的含量,提示移植的外源BMSCs可能通过分化为DA能神经元或促进其功能恢复,增加DA的分泌,进而改善PD模型的症状。     

脂肪源间充质干细胞治疗犬急性肾衰竭的疗效观察

为了研究犬异体脂肪源间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)移植对钩端螺旋体引起的急性肾衰竭(Acute renal failure,ARF)的治疗效果。采用Ⅰ型胶原酶消化法分离犬的脂肪MSC;通过静脉注射MSC对1例钩端螺旋体引起的急性肾衰竭犬进行治疗。结果显示,犬脂肪MSC呈长梭形、三角形或多菱形等形态、贴壁生长;干细胞移植治疗后一周,病犬精神恢复良好,饮食正常,检测血液肌酐和血磷含量下降至正常范围内,尿素氮含量明显下降且接近正常范围。表明犬脂肪MSC移植能有效治疗钩端螺旋体诱发的急性肾衰竭。     

犬间充质干细胞在兽医临床的应用探析

近些年来,随着再生医学和组织工程的发展,干细胞在兽医临床中的应用已成为研究热点。干细胞是具有多重分化潜能的自我复制细胞。根据干细胞所处的发育阶段,可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来源于囊胚的内层细胞团,而成体干细胞则起源于内胚层、中胚层或外胚层的组织。间充质干细胞(MSC s)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一种多能干细胞,最初在骨髓中被发现。     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养

旨在对山羊的骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行分离培养。将分离得到的BMSCs进行传代培养,采用RT-PCR法检测其干细胞转录因子oct4和sox2基因,以验证其干细胞特性;在此基础上绘制BMSCs的生长曲线,对其生物学特性进行直观了解。结果表明,分离到的山羊BMSCs原代细胞呈现出成纤维样,并能够表达oct4和sox2基因,证明了其干细胞特性;其生长曲线呈"S"型,在1~2 d时为潜伏期,第3天时进入指数生长期,第7天时进入平台期。结果提示,分离得到的细胞具有BMSCs的特性,能够用于后续的相关试验研究。     

不同代次大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞成骨分化比较

本研究旨在观察不同代次骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外培养的生长特点和体外诱导成骨能力。通过密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,用含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并利用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及PCR方法检测成骨细胞。结果表明骨髓及脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速。第5、10、15、20代BMSCs及ADSCs经诱导培养后茜素红染色呈阳性并且出现"矿化"、碱性磷酸酶活性强,随着细胞代次的递增,诱导后细胞碱性磷酸酶活性呈递减趋势;诱导后的两类细胞传代后细胞仍能继续分化,并形成正常的"矿化"结节,且碱性磷酸酶染色均弱于初次诱导。结果提示,BMSCs及ADSCs易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力强且成骨细胞传代培养仍具有成骨能力,适合作为再生医学骨组织工程的种子细胞。     

细胞自噬对犬骨髓间充质干细胞干性的影响

本研究旨在探讨细胞自噬对犬骨髓间充质干细胞（cBMSCs）干性的影响。分离培养cBMSCs,将其分为对照组、使用雷帕霉素促进细胞自噬的雷帕霉素组、使用3-MA抑制细胞自噬的3-MA组,于药物处理12、24、48 h后收集细胞,利用间接细胞免疫荧光法检测自噬微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ（LC 3Ⅱ）的蛋白表达水平;荧光定量PCR检测自噬相关基因LC 3、Beclin 1、自噬相关基因7（Atg 7）以及干性相关基因性别决定基因相关转录因子2（Sox 2）、特异AT序列结合蛋白2（Satb 2）mRNA转录水平;通过茜素红染色检测经成骨诱导的cBMSCs的成骨分化能力,通过油红O染色检测经成脂诱导的cBMSCs的成脂分化能力。结果显示：雷帕霉素组的LC 3Ⅱ蛋白表达量上调,3-MA组则为下调。雷帕霉素组干性相关基因与自噬相关基因在不同时间点的表达水平均有不同程度的上调,且随感染时间的延长呈上调趋势;3-MA组干性相关基因与自噬相关基因的mRNA转录水平在不同时间点不同程度降低,且随感染时间延长呈下调趋势。成骨诱导试验中雷帕霉素组cBMSCs形态变化最明显,且矿化面积较大,3-MA组细胞矿化面积小;成脂诱导试验中雷帕霉素组脂滴数量少,3-MA组脂滴数量多且聚集程度高。在一定程度上促进cBMSCs自噬水平可以更好地维护其干性并提高成骨分化能力,为优化治疗中cBMSCs的质量提供理论基础和技术支持。     

骨碎补总黄酮对缺氧环境中犬骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响

拟研究骨碎补总黄酮对缺氧环境中犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.运用骨碎补总黄酮(TFDR)干预低氧浓度(10％)环境中犬BMSCs 4周后诱导成骨分化,倒置显微镜观察茜素红染色BMSCs钙结节形成,比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性水平,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位,激光共聚焦显微镜和RT-PCR...     

野猪骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学特性

采用全骨髓培养法对野猪股骨中骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSC）进行分离、培养并传代,建立野猪骨髓间充质干细胞体外培养方法及对其生物学特性进行观察研究。结果显示,细胞形态呈梭形,漩涡状生长,生长曲线为典型S型,在诱导液作用下,可分化为成脂肪样细胞。结果表明,通过本方法能够分离到较纯的BMSC,为野猪资源保存和体细胞核移植提供技术支持。     

Production and Identification of Clone Sheep Using Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells as Donor Cell

In order to obtain the cloned sheep using bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）as the donor cells,the BMSCs of sheep were chosen and reconstructed embryos were built to transfer.10 published microsatellite markers were chosen,and the DNA samples from clone sheep,donor cells and surrogate ewes were amplified,and the relationship of father-son（RCP）was analyzed using the Quantity One for genotyping.The results showed that the reconstructed embryos were successfully built for electric fusion using sheep BMSCs as nuclear donor,and making nuclear transplantation into enucleated mature oocytes of which the fusion rate was 80.62%.20 surrogate ewe were chosen to be implanted with the reconstructed embryos at morula stage by implant surgery,and 5 lambs were born and only 3 were survived.The genotype of cloned sheep was in line with the dornor cell and the RCP were more than 99.999%.In conclusion,the first clone sheep were obtained successfully by using BMSCs as a nuclear donor in this experiment.     

骨髓间充质干细胞为核供体的克隆绵羊的生产与鉴定

本研究旨在采用骨髓间充质干细胞（BMSCs）为核供体进行体细胞核移植,以获得成体干细胞克隆绵羊。选择幼体绵羊BMSCs为核供体,构建重构胚进行克隆胚胎移植,克隆绵羊诞生后,选取IASG上公布的绵羊10个微卫星标记位点,PCR扩增克隆羊、供体细胞及代孕母羊微卫星DNA,利用Quantity One软件进行基因分型,计算供体细胞与克隆羊之间的父子关系相对机会（RCP）值。结果显示,以幼体绵羊BMSCs为核供体,与去核成熟卵母细胞进行核移植,构建重构胚进行电融合,其融合率达80.62%,重构胚发育至桑椹胚阶段,经手术植入20只代孕母羊,获得克隆绵羊5只,成活3只。克隆羊基因型与供体细胞一致,供体细胞与克隆羊之间的RCP≥99.999%,证明克隆羊来自幼体绵羊BMSCs。本试验最终成功获得了首例以BMSCs为核供体的克隆绵羊。     

Study on Inducing Equine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Differentiated into Chondrocytes

This study was aimed to establish equine bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) line and induce it to differentiate into chondrocytes. The BMSCs were collected by cutting the bone and flushing the cutting surface by PBS, and then the bone marrow was washed with PBS,the collected cells were cultured after centrifugation. The cells were purified by passaging,the stem cell properties were tested before the induction. And the cells were also appraised by the expression of the special gene of chondrocytes as well as staining the differentiated cells with Alcian blue to insure the induction was effective. The obtained BMSCs expressed Sox2 and Nanog genes, which were the stem cell special genes, and also expressed CD44, CD90 and CD105 genes, but absent of CD34 and CD45 genes. The shapes of the 3rd passage BMSCs were changed after cultured in inducing medium for a few days. Furthermore, the cells were positive to Alcian blue staining, increased expression of the Col special gene of chondrocyte day by day as well. According to this study, the BMSC line was established, and the BMSCs were induced and differentiate into chondrocytes successfully.     

马骨髓间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化

试验旨在建立马骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）细胞系,并诱导其向软骨细胞分化。通过获取马BMSCs,进行细胞培养和纯化,对第3代（P3）细胞进行干细胞特性鉴定,并诱导其向软骨细胞分化,对分化后的细胞染色,并检测其软骨细胞特异性基因的表达。结果显示,获得的马BMSCs表达标记基因Sox2和Nanog,并表达间充质干细胞表面标记因子CD44、CD90和CD105,不表达造血细胞表面标志物CD34和CD45。P3代细胞经诱导培养后形态发生改变,阿尔新蓝染色为阳性,并表达软骨细胞特异基因Col,且其表达量随着诱导分化时间的增加而增高。综上表明,本试验建立了马BMSC细胞系,并成功诱导其分化为软骨细胞,为软骨损伤的干细胞治疗提供了试验依据。     

崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

为研究崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化潜能,采用P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs进行体外成脂和成神经诱导分化。结果显示,当细胞传至P30代时,TERT-BMSCs生长旺盛;在成脂诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能观察到细胞中透明脂滴的形成,油红O染料染色后可见脂滴被染成红色;在成神经诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能形成树突样或三角形的形态,甲苯胺蓝染色后可观察到细胞中尼氏体的存在。综上提示,永生化的崂山奶山羊BMSCs在多次传代后仍具有较强的多向诱导分化能力,这为永生化MSCs的广泛应用提供了理论依据。     

崂山奶山羊骨髓间充质干细胞永生化细胞系的建立

为建立崂山奶山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)永生化细胞系,将已构建的pcDNA3.1-EGFPTERT转入崂山奶山羊BMSCs中,利用含G418的培养基筛选获得稳定转染的TERT-BMSCs;通过多次传代,测定其生长曲线;选取高代次TERT-BMSCs的分裂中期相的细胞,检测其染色体及核型的稳定性。结果表明,转入TERT基因的崂山奶山羊BMSCs能够稳定表达该基因,其生长曲线呈"S"形;在多次传代后,P40代细胞的核型正常率仍能达到88.24%。综上提示,转染得到的TERT-BMSCs具有良好的生长状态,其细胞生长稳定,符合永生化细胞特征,为间充质干细胞应用于组织修复及基因工程种子细胞的制备提供了理论基础。     

生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响

旨在研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外生长及增殖的影响。体外培养并鉴定兔BMSCs,用不同浓度的bFGF(5、10、20、40、80和100μg.L-1)作用于兔BMSCs,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、流式细胞仪观察细胞的生长及增殖情况。结果,经免疫细胞化学法和分化反推法鉴定所分离培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞;MTT法结果显示,bFGF浓度为80μg.L-1时细胞的增殖能力最强(P<0.01),在培养第3天即出现显著的促增殖作用(P<0.01);流式细胞仪结果显示,bFGF组BMSCs的增殖指数明显高于对照组(P<0.01)。说明bFGF有促进体外培养兔BMSCs增殖的作用,浓度为80μg.L-1时促增殖能力最强,可以作为体外扩增培养兔骨髓间充质干细胞的最佳培养条件。