鸽新城疫病毒弱毒株的分离与鉴定

对某鸽场送检的6只通过病理剖检疑似新城疫(ND)的病鸽进行实验室诊断,包括细菌分离、新城疫病毒荧光RT-PCR检测、SPF鸡胚分离与鉴定,并测定其鸡胚分离物F3代EID50和ICPI.结果为内脏病料新城疫病毒荧光RT-PCR检测为阳性;SPF鸡胚分离到一株有血凝活性的病毒,经HA和HI鉴定为NDV,其F3代血凝价为1∶26,EID50为107.63,ICPI为1.19.根据病鸽的临床症状、鸡胚分离物EID50和IC-PI,确定该鸽新城疫病毒分离株为弱毒株.     

鸽新城疫病毒分离株的部分生物学特性鉴定及疫苗免疫试验

从暴发疑似鸽新城疫的某赛鸽场分离到1株病毒，通过血凝（HA)试验、血凝抑制（HI）试验及鸡胚中和试验初步鉴定为鸽新城疫病毒，进而进行了鸡胚半数感染量（EID50）、鸡胚平均死亡时间（MDT）测定和对不同动物红细胞的凝集试验，证明该分离株属新城疫强毒力毒株，将该毒株经鸡胚尿囊液增殖后用甲醛灭活，制成油佐剂来活苗，对鸽免疫后检测其血清抗体水平并进行攻毒试验，结果在免疫后21d抗体达到高峰，攻毒试验表明油佐剂灭活苗对鸽新城疫病毒感染有较强的保护力。     

鸽新城疫病毒测定方法的比较研究

对ＰＢ９６０１毒株的第７代和第３６代的尿囊液采用了鸡胚半数致死量和细胞半数感染量两种方法进行对比试验，结果表明，细胞半数感染量测定法较为实用。     

我国鸽新城疫病毒某些生物学特性研究

对我国分离的鸽新城疫坪山毒和川沙毒对鸡胚致死性、鸡胚传代毒的血凝价、对健康鸽致病性以及对鸡胚细胞感染性等一些生物学特性进行了研究和比较,结果表明:二毒株接种鸡胚都能使鸡胚致死,川沙毒致死鸡胚时间略早于坪山毒.二毒株都能在鸡胚传代,鸡胚毒血凝价平均值约2~■.毒株感染鸡胚细胞能规律性地对细胞引起病变作用.对健康鸽都具有致病性,川沙毒致病性指数高于坪山毒,并能引起四周龄肉鸡发病.     

新城疫单抗ELISA试剂盒检测鸽新城疫病毒

用新城疫（ND）单抗酶联免疫（ELISA）试剂盒检测23例疑似ND的鸽泄殖腔棉拭样品，7份阳性样品用SPF鸡胚均会离到病毒，该病毒凝集鸡红细胞，并就抗新城疫病毒（NDV）阳性血清所抑制，其中4株病毒的MDT在48－68.6h之间，ICPI为1.55-1.85。试验结果表明所分离的病毒为NDV，亦表明ND单抗ELISA试剂盒能够检出鸽NDV，并可作为鸽群中NDV流行病学调查的有效手段。     

6株鸽源新城疫病毒广西分离株F基因的遗传演化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的6株鸽源新城疫病毒F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示:只有1株分离株F基因的ORF全长为1 659 bp,编码552个氨基酸,其他5株分离株F基因的ORF全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,6株分离株的F0蛋白裂解位点的序列均为112RRQKRF117,符合强毒株的序列结构特性;核苷酸同源性比较显示,6株分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为91.3%~99.3%(与比利时分离株11(JX901124)的同源性最高),与其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%~89.2%。与经典强毒株F48E9相比,核苷酸序列同源性为83.6%~84.8%,氨基酸序列同源性为89.2%~92.4%;与Ⅰ型疫苗株V4、I-2相比,核苷酸同源性分别为83.6%~85.1%和82.6%~84.2%,氨基酸序列同源性分别为88.1%~91.3%和87.7%~90.8%;与Ⅱ型疫苗株La Sota和B1相比,核苷酸同源性分别为81.7%~83.9%和82.0%~83.9%,氨基酸序列同源性分别为86.6%~89.9%和86.6%~89.9%。遗传进化分析显示,6株广西鸽源分离株与2011年比利时分离株11(JX901124)和中国毒株SDS、LLN713、BJP13、LJL404、P4的遗传关系最为接近,位于同一进化树分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

三株鸽新城疫病毒新疆分离株F基因序列分析及遗传起源探讨

用RT-PCR方法从3株鸽新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)新疆分离株中扩增出F基因裂解位点前后482 bp片段,将其克隆至pGEM-T Easy载体并进行核苷酸序列测定。用DNAStar软件对分离株的F基因片段与国内外相关的NDV参考株进行比较,结果表明3个分离株之间核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.6%～99.8%和99.4%～100.0%,与其它鸽源NDV F基因相应部分核苷酸及氨基酸序列同源性分别为89.4%～98.1%和90.6%～98.1%,而与国内代表性弱毒疫苗株LaSota毒株和NDV强毒株F48E9的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为86.3%和87.6%及90.0%和92.5%。遗传发育进化树分析表明3个分离株属NDV基因型Ⅵ,与法国株(Pigeon-France-99)、意大利株(Pigeon-Italy-00)形成同一细分支,其核苷酸同源性为97.9%～98.1%,F基因的裂解位点氨基酸序列都为112R-R-Q-K-R-F117,是典型的强毒株共有序列,新疆鸽流行株与欧洲鸽流行株有很近的遗传亲缘关系,为同一基因亚型。对疫病流行时间、新疆独特的地理位置和病毒基因遗传衍化关系等方面进行综合考虑与分析,2000年开始在新疆地区流行的鸽NDV和欧洲国家上述流行株具有共同的遗传起源,推测通过从国外引种或者候鸟迁移等途径传播的可能性较大。     

鸽新城疫病毒野毒PB9601株的致病性研究

用不同方法测试了从新城疫患鸽分离到的新城疫病毒（ＮＤＶ）野毒ＰＢ９６０１株的致病性。结果,该毒株对１日龄ＳＰＦ雏鸡的脑内接种致病指数为２．００,对６周龄ＳＰＦ鸡静脉接种致病指数为０．００;该毒株对６周龄左右鸽有很强的致病性,有的血清中已有一定量的抗鸽ＮＤＶ抗体;经ＳＰＦ鸡胚传１３代的尿囊液病毒对鸽的半数致死量约为１２个ＴＣＩＤ５０。由此认为,ＰＢ９６０１株ＮＤＶ是对鸡致病性很弱但对鸽呈高度致病性的毒株,可作为国内鸽ＮＤＶ强毒的参考株。     

鸽新城疫病毒分离株F0裂解位点的基因克隆及序列分析

为探讨新鸽新城疫的流行特点，在分子水平上阐明鸽新城疫病毒分离株与鸡新城疫病毒株之间的相互关系，我们用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了分离株Ｆ０裂解位点附近３００ｂｐ的基因片段，将其克隆到ｐＵＣ１９载体上得到一重组克隆ｐＮＤ２１，序列分析表明，插入片段与鸡新城疫强毒Ｔｅｘａｓ相应区域的同源性为８７．７％，而与弱毒株Ｄ２６／７６及ＬａＳｏｔａ同源性分别是９１．７％和９８％，其Ｆ０裂解点的氨基酸顺序为Ｇｌｙ－Ａｒ     

一株肉鸽新城疫强毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从病死鸽的内脏组织中分离到一株新城疫病毒(命名为GD-09株),该病毒能使鸡红细胞发生凝集,且这种凝集能被鸡新城疫标准阳性血清所抑制。经测定,其鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数（ICPI）分别为57.6 h、1.74,表明该新城疫病毒为强毒。通过分析其融合蛋白（F）发现,F蛋白多肽裂解位点为¹¹²RRQRRF¹¹⁷,符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因分型及氨基酸同源性比较发现,GD-09株属于基因Ⅵ型,与La sota、F48E9、B1、V4等传统毒株同源性较低,与鸽源NDV同源性较高。     

一起鸽群新城疫强毒感染的诊断

为对发病鸽群进行诊断,采集发病鸽群血清,检测血清中新城疫抗体,同时提取病鸽脑组织总RNA样本通过RT—PCR进行新城疫病毒F基因检测,并从病鸽脑组织中分离鉴定新城疫病毒。结果表明,该发病鸽群为新城疫强毒感染。     

鸽新城疫病毒北京分离株F基因的遗传进化分析

对一株分离自北京市的鸽源新城疫病毒BJP13株的F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示,F基因核苷酸序列长为1 662bp,编码553个氨基酸,蛋白裂解位点的序列为112RRQKRF117,具备强毒株的序列特征;同源性比较显示,BJP13与国内外不同基因型毒株的同源性在87.9%~99.1%;与新城疫基因Ⅵ型的同源性较高,为93.7%~99.1%,其中与基因Ⅵb亚型中的毒株11和毒株LLN713同源性最高为99.1%,与1996年北京分离株STP96的同源性最低为93.7%;与基因Ⅰ型疫苗株V4株和基因Ⅱ型疫苗株La Sota株的同源性分别为90.3%和88.6%;遗传进化分析显示,北京分离株BJP13与比利时毒株11、4940和中国毒株SDS、LLN713最为接近,位于同一进化分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

鸽新城疫病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从疑为鸽新城疫的浙江温州某肉鸽场分离到一株毒株。该毒株能凝集鸡红细胞,初代分离毒HA效价高达8 log2;且其凝集作用能被鸡新城疫标准阳性血清抑制;将分离毒回归鸽,复制出与自然病例相似的临床症状和病变,且感染后10d内全部死亡,说明为强毒株。试验结果表明该毒株为鸽新城疫病毒。     

鸽新城疫病毒的分离及其生物学特性测定

用ＳＰＦ鸡胚从疑似鸽新城疫（鸽ＮＤ）病鸽群中分离到一株病毒ＱＬ株,该病毒株能凝集鸡红细胞（ＲＢＣ）,这种凝集作用能被抗新城疫病毒（ＮＤＶ）阳性血清抑制;用抗ＮＤＶ单抗ＰＥＧ夹心ＥＬＩＳＡ测定分离株为阳性。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡,出现与自然发病鸽一致的症状和病变,但肌注ＳＰＦ鸡只感染,不见临床症状。对该分离株作进一步生物学特性鉴定,按照国际上规定的ＮＤＶ毒力判定标准,测定了该毒株最低致死量致死鸡胚的平均死亡时间（ＭＤＴ）、１日龄雏鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄雏鸡静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）,结果ＭＤＴ为１０５小时、ＩＣＰＩ为１．３３、ＩＶＰＩ为１．０。试验结果表明本分离株为鸽新城疫病毒。     

2株鸽源新城疫病毒的毒力鉴定和基因型分析

2008年从临床鸽病例中分离到2株新城疫病毒毒株,经测定,鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为48h和46h,8周龄SPF鸡静脉接种指数(IVPI)分别为2.88和2.91,一日龄雏鸡脑内接种指数(IPCI)分别为1.88和1.89,按照OIE推荐的标准均为强毒株。RT-PCR扩增出融合蛋白(F)基因片段,测序,推导的氨基酸序列中蛋白酶裂解位点附近的氨基酸序列均符合强毒特征序列。根据F蛋白的部分基因序列绘制的系统进化发生树和F基因片段中3种限制性内切酶(RE)位点分布判定这2个毒株均为基因Ⅶc型。     

鸽新城疫病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从疑似鸽新城疫的信鸽饲养场分离到一株新城疫病毒。分离株利用电镜负染技术观察到典型的新城疫病毒粒子。生物学试验表明,该株病毒具有较强的毒力,最小致死量鸡胚平均致死时间（MDT）为68.4小时,1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1.375,6周龄雏鸡静脉接种致病指数（IVPI）为1.34,在鸡胚成纤维细胞上能引起细胞病变。动物回归试验证明,分离株能致2月龄鸽死亡。     

进口法国种鸽新城疫病毒的分离和鉴定

用鸡成纤维细胞和鸡胚从30只进口法国种鸽中分离出一株病毒,细胞培养物的HA效价为3log2,尿囊液的HA效价为4log2,新城疫阳性血清能抑制这种血凝作用,HI效价均为7log2,禽流感阳性血清不能抑制这种血凝作用.通过透射电镜观察、毒力测定等最终确认,分离出的病毒为新城疫病毒.     

一株新城疫重组强毒的分离鉴定与分子特性分析

从患病蛋鸡中分离出1株新城疫病毒(NDV)SRZ/03,经蚀斑纯化后接种40日龄SPF鸡可诱发典型ND病变。蚀斑纯化前、后,MDT分别为55.2和51 h,ICPI为1.7和2.0,IVPI为1.91和2.79,表明属强毒。对其F和HN基因分别克隆测序,进行F基因分型。结果表明SRZ/03属基因Ⅱ型,F蛋白氨基酸裂解位点的序列为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒基序完全相同。结合GenBank中发表的其他NDV参考株序列,对F和HN基因推导氨基酸序列进行比较。SRZ/03株与基因Ⅱ型LaSota/46、B1/47、Bingham/87和Texas/48的同源性分别为93.1%、93.0%、94.4%和94.4%;与基因Ⅶ型Taiwan/95、SGM/01和SKY/03的同源性分别为92.2%、92.8%和92.8%;与基因Ⅲ型F48E9/48的同源性为91.2%。然而,SRZ/03株F蛋白前210个氨基酸与基因Ⅱ型LaSota/46和Texas/48的同源性较高,达96.7%和98.1%,后343个氨基酸则与Taiwan/95、SGM/01等毒株的同源性较高,达95.7%~97.4%,推测该株为重组株。此外,SRZ/03株与Taiwan/95、SGM/01等毒株的HN氨基酸同源性高达95.8%~97.6%,显著高于与LaSota/46、B1/47、Bingham/87、Texas/48和F48E9/48的87.2%~89.2%。     

白鹭源新城疫病毒的分离与鉴定

从1只患病的白鹭的咽喉、泄殖腔棉拭子中分离到1株病毒,经血凝、血凝抑制试验和RT-PCR法鉴定为新城疫病毒。根据该毒株对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、鸡胚半数感染量的测定和新城疫强弱毒鉴别的RT-PCR检测,表明该分离株为新城疫强毒株。