产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。     

Undifilum oxytropis次级代谢产物GC-MS分析及抗肿瘤活性研究

研究疯草内生真菌(Undifilum oxytropis),次级代谢产物成分与活性,通过GC-MS对菌丝体及发酵液进行了分析,并通过MTT法测定抗肿瘤活性。结果表明,菌丝体和发酵液中均以烷烃和酯类物质为主,菌丝体中检出活性物质角鲨烯(0.863%);菌丝体对HCT-8人回盲肠癌细胞和OS-RC-2人肾癌细胞抑制率均较高,发酵液对HCT-8人回盲肠癌细胞抑制率相对较弱。     

宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础。分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能产生苦马豆素的内生真菌;紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢;提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD）、内部转录间隔区（internal transcribed space,ITS）和线粒体核糖体小亚基（mitochondrial small subunit,mt SSU）基因序列,进行同源性比对和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名。本研究从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能产生分生孢子及分生孢子梗等结构;序列同源性和系统发育分析结果表明,该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis。     

产苦马豆素疯草内生真菌Undifilum oxytropis原生质体的制备和再生

以产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis NX-FEL001为供试菌株,研究了培养方式、菌龄、酶解时间和酶解温度等,对U.oxytropis原生质体制备和再生的影响。结果表明,U.oxytropis菌丝在质量分数为10g/L纤维素酶+10g/L蜗牛酶+1g/L溶壁酶组成的复合酶溶液,35℃恒温,80r/min振荡孵育3h左右,原生质体释放量最高;原生质体在YCM培养基上,22℃培养9d可以再生形成菌落,培养15d其再生率可达8.5%;原生质体在YCM培养基上再生后其菌落颜色与野生型U.oxytropis不一致,呈现白色;菌丝形态与野生型U.oxytropis相一致,经检测再生后菌丝仍然能够产生苦马豆素。U.oxytropis原生质体的制备,将为进行疯草内生真菌的遗传转化和基因操作研究提供重要工具,为进一步开展疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机制奠定了基础。     

产苦马豆素真菌的筛选与鉴定

为探明青海及内蒙古多种疯草类植物及其根际土壤中是否存在产生苦马豆素的真菌,并对其种属进行鉴定,同时测定其苦马豆素产率。本试验拟对采自内蒙古和青海的疯草样品中的内生真菌及根际土壤真菌进行分离;应用薄层色谱和气相色谱法分别检测菌丝及发酵液中苦马豆素含量,筛选可产生苦马豆素的真菌;运用形态学和分子生物学方法对其属种进行鉴定。从青海采集的疯草样品中分离并筛选出2株可产苦马豆素真菌,一株为土壤真菌,一株为内生真菌,分别命名为FS-5和EFG-7;菌丝中苦马豆素含量分别为0.773和0.11 mg.g-1,结合形态学和分子生物学试验结果,确定这2株真菌分别为裂褶菌属真菌和镰孢菌(霉)属三线镰刀菌。结果显示,我国青海疯草及根际土壤中存在可产生苦马豆素的真菌。     

疯草内生真菌研究进展

疯草内生真菌Undifiumn oxytropis是由分布于我国西北地区的疯草中分离得到的一类内生真菌,其代谢产物苦马豆素(swainsonine,SW)具有良好的抗肿瘤活性,还能导致牛、羊疯草中毒,对我国草原畜牧业造成了严重的危害。论文对疯草内生真菌的分布、生长特性、SW抗肿瘤活性以及疯草内生真菌生物合成SW的研究进展做一综述,为有关研究提供参考     

小花棘豆产苦马豆素内生真菌的筛选与鉴定

通过对小花棘豆内生真菌的分离纯化,筛选产苦马豆素内生真菌,探讨小花棘豆内生真菌与其毒性成分苦马豆素的相互关系。本研究对采自内蒙古西部草地的6份小花棘豆样品进行内生真菌分离纯化,采用薄层色谱和气相色谱技术对内生真菌发酵液进行苦马豆素定性、定量检测,筛选产苦马豆素内生真菌;结合形态学和分子生物学方法进行内生真菌种属鉴定。从小花棘豆样品中分离得到6株内生真菌。经筛选,其中有2株产苦马豆素,编号为XJ-J-I和XJ-H-1,其发酵液中苦马豆素产量分别为4.209 2mg.L-1和16.733 8mg.L-1。鉴定结果表明,这2株内生真菌虽然形态学存在差异,但基因型相同,同属镰刀属内生真菌—层出镰刀菌(Fusarium prolifera-tum)。小花棘豆中存在产苦马豆素内生真菌。     

直立黄芪中产苦马豆素真菌的分离与鉴定

为了确定直立黄芪中是否存在能产生苦马豆素的真菌及该类真菌与链格孢属波状芽管孢组疯草内生真菌的遗传进化关系,对直立黄芪植物组织中的真菌进行了分离,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法和超高效液相色谱-串联质谱法对分离菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能够产生苦马豆素的菌株。PCR法扩增产苦马豆素真菌的内部转录间隔区(ITS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)和β-酮脂酰合酶(β-ketoacyl synthase,KS)基因,测定其序列,进行序列一致性比对。基于ITS和GPD序列构建系统发育树,根据遗传进化分析结果和形态特征,对直立黄芪中的产苦马豆素真菌进行种属分类和命名。结果显示:从直立黄芪中共分离到43株真菌,其中有13株菌丝中含有苦马豆素,序列一致性和系统发育分析结果表明,该类真菌与已报道的直立黄芪病原真菌甘肃链格孢(Alternaria gansuense)和产苦马豆素疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum sp.)的亲缘关系最近。直立黄芪中存在能产生苦马豆素的真菌,根据形态特点和遗传进化分析结果,本研究将从直立黄芪中分离的产苦马豆素真菌划分到链格孢属波状芽管孢组中,并命名为甘肃波状芽管孢(Alternaria Section Undifilum gansuense)。     

疯草及毒性成分研究进展

疯草是指含苦马豆素的豆科黄芪属和棘豆属有毒植物,能引发家畜疯草病。疯草的分布比较广泛,属于世界性有毒植物,近年来疯草蔓延迅速,在一些地区已经造成草地毒草化,频繁出现放牧家畜中毒死亡现象,严重威胁草地畜牧业发展。研究表明,疯草的毒性与其含有的苦马豆素有关,但苦马豆素却不是疯草自身代谢产物,而是疯草携带内生真菌的代谢产物,此外苦马豆素还是一种良好抗肿瘤药物。笔者结合国内外相关研究对疯草的分布、危害、防治及毒性成分研究进展进行综述,并对疯草分类、研究地域及利用前景进行了讨论。     

苦马豆素的来源、药理作用及检测方法研究进展

吲哚里西啶类生物碱苦马豆素是疯草及其内寄生真菌的代谢产物,其有良好的抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫力的作用,具有巨大的药用潜力。作者简要阐述了苦马豆素的药理作用、检测方法、药用价值和研发潜力,并对其来源及疯草内生真菌合成苦马豆素的相关研究进展进行总结,以期丰富苦马豆素的来源,为其在科研和医疗上的广泛应用提供保障。     

枯草芽孢杆菌BSPE2501对草坪炭疽病菌的抑制作用

测定了枯草芽孢杆菌BSPE2501菌体和在不同培养时间、培养基、培养基量、转速条件下获得的发酵液对草坪炭疽菌的抑制作用.结果表明:BSPE2501菌体对病原菌菌丝生长和孢子萌发均有明显抑制作用;在NB和BPY中培养获得的发酵液的抑制作用高于在LB和PD中的抑制作用,其1倍发酵液对菌丝生长的抑制率分别达到66.2%和65.5%,明显高于LB(53.5%)、PD(45.8%)的抑制率;其孢子萌发抑制率分别为44.6%、43.1%,高于LB(35.2%)、PD(28.6%)的抑制率;在NB中培养72h、培养基量为100ml、培养转速为150r/min等条件下获得的发酵液的抑菌效果最好,在此条件下获得的1倍发酵液对菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为85.3%和46.9%、75.7%和43.1%、67.2%和43.4%.     

swnR基因在金龟子绿僵菌合成苦马豆素中的作用

苦马豆素（swainsonine, SW）是由内生真菌产生的疯草类植物的主要有毒成分,目前有关其生物合成通路及关键催化酶基因尚不十分清楚。有研究表明,SW的合成主要依赖于真菌中SWN基因簇的基因,为探明该基因簇中编码NADB Rossmann-fold还原酶的swnR基因的作用,本文以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）为研究对象,使用PEG介导的同源重组（HR）敲除金龟子绿僵菌swnR基因,通过高灵敏质谱仪检测野生型（WT）、突变型（MT）和回补型（CT）菌株发酵产物中SW含量。结果显示,野生型、突变型和回补型菌株发酵液中的苦马豆素含量分别为（82.91±15.92）、（5.71±2.23）和（56.42±10.82） μg·mg^-1,突变菌株发酵液中SW含量显著降低,回补菌株发酵液中的SW含量恢复明显。swnR基因是金龟子绿僵菌合成苦马豆素的关键催化酶基因,本研究为后续开展疯草内生真菌合成苦马豆素的催化酶基因筛选及其生物合成通路研究奠定理论基础。     

冰川棘豆生物碱分析及苦马豆素的分离、鉴定

冰川棘豆干粉,经甲醇提取,盐酸酸化,酸水液用氯仿萃取数次,NaOH调pH至9～10,依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取.称重表明生物碱多集中在正丁醇组分,且以大极性生物碱为主.薄层层析检查结果显示,氯仿组分有10种生物碱,乙酸乙酯组分有7种生物碱,正丁醇组分有5种生物碱.将正丁醇组分经硅胶柱层析,乙酸乙酯一甲醇系统梯度洗脱,每30～50 mL收集1份,薄层层析监测,同类合并.Ehrlich＇s试剂显色明显段油浴升华,得到白色针状结晶,与苦马豆素标准样品进行薄层层析对照,其斑点形状、颜色相同,Rf值相近.通过熔点和IR、MS、^1HNMR、^13CNMR等鉴定其化学结构,为苦马豆素.     

甘肃棘豆内生真菌种群多样性

将采集于青海省祁连县甘肃棘豆的茎和叶部表面消毒后分别置于黑暗和光照条件以及PDA和BDA 2种培养基上进行内生真菌分离纯化,采用形态学和分子生物学分析技术鉴定种属,并计算多样性指数。结果显示,629块植物样品中共分离到内生真菌433株,分属9个科15个属28种,不同的培养条件下优势菌属不同;多样性指数计算结果显示,香农-维纳指数（H）为1.99,均匀度指数（E）为0.60,辛普森指数（D）为0.257。结果表明,采集于青海省祁连县的甘肃棘豆内生真菌多样性比较丰富,可为今后深入探讨甘肃棘豆内生真菌遗传多样性奠定基础,并为产苦马豆素目标菌株的筛选,提供丰富的内生真菌后备菌株。     

茎直黄芪内生真菌分离鉴定及其多样性分析

为探明茎直黄芪(Astragalus strictus)不同组织部位内生真菌种群分布及其物种多样性,对采自西藏工布江达县的茎直黄芪样品,运用形态学和rDNA-ITS序列分析技术鉴定其种属,并计算多样性指数。结果表明:从茎直黄芪424个组织块中分离到内生真菌336株,分属7纲、9目、10科、13属,其中Alternaria tenuissima分离率最高为32.14%,是优势种属,其次是Undifilum oxytropis,分离率为19.05%;多样性指数显示,茎直黄芪不同组织部位内生真菌多样性指数不同,花中内生真菌香农-维纳指数(2.16)及辛普森指数(0.154)及均匀度指数(0.80)均最高,表明其多样性最高,叶次之,茎最低。表明茎直黄芪不同组织内生真菌的数量、种属组成及多样性存在明显差异,花是内生真菌定植的主要部位,且其多样性最高。     

醉鱼草内生细菌ZJ1的抑菌作用及其脂肽类抑菌代谢产物鉴定

为明确醉鱼草(Buddleja lindleyana Fortune)内生细菌ZJ1的抑菌作用及其抑菌代谢物质组成,本研究测定了ZJ1菌株及其发酵液的抑菌作用,分离、纯化及鉴定了ZJ1菌株的抗菌物质,还观察和测定了ZJ1菌株代谢物处理后的Botrytis cinerea菌丝生长状态和细胞膜通透性。结果表明:ZJ1菌株对10种病原菌均有一定抑制作用,其中,活菌及发酵液均对Monilinia fructicola的抑制率最高,分别达95.69%和94.68%;观察ZJ1菌株代谢物的物理特性发现,其代谢物具有排油能力且出现液滴坍塌现象,进一步检测发现ZJ1菌株脂肽类代谢产物中含有表面活性素和泛革素;以B.cinerea作为指示菌,经ZJ1菌株代谢物处理后,B. cinerea菌丝极少产孢,生长异常,发生断裂;细胞膜通透性增大,渗透物质流出,电导率上升。醉鱼草内生细菌ZJ1表现出良好的抑菌作用,其脂肽类代谢产物的鉴定为ZJ1菌株的进一步开发和利用鉴定了基础。     

小花棘豆添加量对卡拉库尔羊利用青贮饲料的影响

试验选用9只健康的雄性卡拉库尔公羊为试验动物,采用全收粪消化试验方法,研究不同的小花棘豆添加量下卡拉库尔羊对青贮饲料的利用率。试验结果表明,小花棘豆添加量在400 g/d和800 g/d时,卡拉库尔羊干物质、粗蛋白、粗脂肪和矿物质采食量均有所提高,NDF和ADF采食量降低;卡拉库尔羊干物质、粗蛋白、粗脂肪、矿物质和ADF的消化率均显著增高,NDF消化率变化不显著。通过对试验羊AMA、AKP、BUN、GOT、GPT、LDH活性的监测,400 g/d和800 g/d的小花棘豆添加量对卡拉库尔羊的健康无明显影响。     

烟管菌M-1菌株对油菜核盘菌的生防作用研究

以自主分离的烟管菌(Bjerkandera adusta)M-1为拮抗菌株,首次探究其对油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制作用,优化其液体培养条件以提升代谢液抑菌效果,为油菜菌核病的生物防治提供新思路。通过菌饼对峙抑菌试验和液体培养液抑菌试验测定菌株M-1抑菌效果,并在显微镜下观察其对核盘菌的重寄生作用;以不同温度水浴处理该菌株代谢液探究其热稳定性。采用单因素试验和响应曲面法确定其最适液体培养条件。在此基础上,通过温室盆栽试验调查菌株M-1对油菜菌核病的防病效果。结果表明,菌饼对峙抑菌试验中菌株M-1对油菜核盘菌的抑菌率达到67.9%,显著高于多菌灵(22.7%)和甲基托布津(31.4%),而液体培养液抑菌试验中其无菌代谢液对油菜核盘菌的抑菌率为51.8%,分别是多菌灵处理和甲基托布津处理的1.3和2.2倍。显微观察发现该菌株对油菜核盘菌具有明显的拮抗作用,在拮抗区两者菌丝形态均发生变化,扫描电镜下则清晰地观察到菌株M-1菌丝直接穿插、刺透油菜核盘菌菌丝,使后者菌丝膨大、变形甚至裂解,表现出强烈的重寄生作用。经过80 ℃甚至100 ℃水浴后,菌株M-1代谢液抑菌率仍在35%以上,显示出一定的热稳定性。对该菌株液体培养条件优化后确定了最佳条件组合:C/N为7.5,pH为4.7,装瓶量为33%,时间为22 d,转速为180 r·min^-1,温度为32 ℃,优化后其代谢液抑菌率能够提升到80.9%。温室盆栽试验调查发现其对油菜菌核病的防病效果达到71.4%,高于多菌灵处理(53.2%)。烟管菌M-1作为生防真菌对油菜核盘菌具有很好的抑制作用,条件优化后进一步提升了生防效果,在油菜菌核病的生物防治中具有广阔应用前景。     

庆大霉素发酵液检测方法研究

在庆大霉素微生物发酵过程中,探索发酵液中庆大霉素效价的快速测定方法。在优化的发酵工艺条件下发酵生产庆大霉素,分别运用旋光法、紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)对庆大霉素发酵液的效价进行测定。结果最佳发酵条件为:种瓶接种量2 cm2,种龄24 h,发酵瓶接种量12%,发酵周期5 d。优化后的庆大霉素发酵液效价相较于优化前提高70%左右。紫外分光光度法、HPLC法和旋光法测定的庆大霉素发酵液效价产生的误差均小于3%。三种检测方法均能运用在庆大霉素发酵液效价的快速检测中。旋光法操作简单但对标准品需求量大,紫外分光光度法耗时短但只能测定庆大霉素总体效价,HPLC法需要出峰时间。因此,在庆大霉素发酵液效价测定中需根据自己的需求选择最佳检测方法。