一株猪流行性腹泻病毒S、M、N基因的遗传变异分析

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株与流行毒株的遗传变异和抗原位点的差异性,以RT-PCR进行PEDV CV777疫苗株和JS2016流行株S、M、N 3个基因的克隆测序,进行PEDV S、M、N 3个基因的核酸序列同源性分析,并通过软件比对CV777与JS2016毒株在这3个基因上的抗原差异。S、M、N基因的同源性分析表明流行毒株与CV777存在变异,但同源性在93%以上;免疫原性预测结果显示2个毒株在S、M、N 3个基因上的抗原区域存在较小的差异。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株S基因遗传变异分析

为分析山西地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,试验利用RT-PCR方法对2014-2015年山西省疑似猪流行性腹泻的阳性病料进行克隆和测序,获得4个S基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行比对分析。序列分析结果显示,4株PEDV山西分离株的S基因与CV777 vaccine相比,在170~171 bp之间插入12个核苷酸,在401~402、454~455 bp之间均插入3个核苷酸,在461~468 bp之间缺失6个核苷酸。4株PEDV山西分离株S基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~99.8%和98.6%~99.7%,与2011-2015年中国流行毒株、CV777 vaccine、attenuated DR13、CV777的核苷酸同源性分别95.0%~98.5%、93.2%~93.6%、93.2%~93.7%、93.7%~94.4%,氨基酸同源性分别为96.2%~98.9%、91.9%~92.6%、92.1%~92.9%、92.9%~94.0%。遗传进化树分析结果表明,PEDV S基因分为3个群,4株PEDV山西分离株属于第一群,与2010年以后国内流行毒株（除AH-M、SQ2014）的亲缘关系较近,与2010年以前中国流行毒株、2个日本株、7个韩国株、2个疫苗株的亲缘关系较远。研究结果提示山西省流行的PEDV发生较明显的变异,需研发新的疫苗来控制PEDV的暴发。     

广西部分猪场猪流行性腹泻病毒S基因克隆及序列分析

采集广西25个猪场的病料,对猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性组织样品进行全S基因扩增.将41株全S基因进行序列比对及遗传进化分析,41株PEDV的S基因之间核苷酸同源性为94.8％～100％,与参考毒株核苷酸同源性为89.3％～99.4％.S基因进化树图谱显示,广西当前流行的PEDV可分为2个谱系.Attenuated...     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒（PEDV）青海株（PEDV-QH）的M基因。经序列分析，PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框（ORF）全长为681bp，包含154A（22．61％），160G23．49％），217T（31．86％），150C（22．03％），编码226aa，分子质量约为25ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1／87、JS2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98．5％、98．4％、98．4％、98．2％和97．9％，推导的氨基酸序列同源性分别为99．1％、99．19／6、98．7％、98．2％、97．8％；M基因推导的氨基酸序列分析显示，M蛋白3次跨膜，有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点，3个潜在的N糖基化位点，4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1／87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示，PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

根据猪流行性腹泻病毒S基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从广东省某猪场采集的初生仔猪腹泻样品检测猪流行性腹泻病毒,并将其克隆测序分析。结果表明,病料样品中有猪流行性腹泻病毒,S基因与KNU-0801、KNU-0901亲缘关系最近,处于同一个分支;与弱毒疫苗株CV777的S基因亲缘关系较远,处于另外一个分支。     

2020-2021年新疆地区猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析

为了解新疆地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,于2020-2021年从新疆地区规模化猪场采集到326份临床仔猪腹泻病料和肠组织,利用RT-PCR方法对PEDV进行检测,选取部分PEDV阳性样品进行S基因全序列的克隆和测序,并对其序列、遗传进化和抗原表位进行分析。结果显示,326份样品中共有152份样品为PEDV阳性,阳性率为46.6%。选取的11份阳性样品中的PEDV S基因核苷酸(氨基酸)同源性为99.0%～100%(98.2%～99.9%),与GenBank中登录的PEDV参考毒株核苷酸(氨基酸)同源性为92.6%～98.0%(91.2%～97.7%),与经典株CV777核苷酸(氨基酸)同源性为93.1%～93.4%(92.3%～92.7%)。遗传进化分析显示,11份阳性样品均位于GIIa亚群,与中国疫苗株CV777处于不同的分群,说明新疆部分地区PEDV流行株与疫苗毒株CV777亲缘关系较远。序列比对结果显示,11份阳性样品中的PEDV S蛋白均存在氨基酸的插入和缺失,中和表位的COE区域变异较大,这可能会降低常规疫苗的免疫保护作用。结果表明,从分子水平明确了2020...     

广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆与序列分析

为研究广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的变异情况,于2012-2013年间从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪样本。通过PCR方法扩增到12个样本的PEDV的S1基因序列,并进行序列比对及遗传分析。结果 12个样本PEDV的S1基因序列之间的核苷酸同源性为91.1%~99.6%,氨基酸的同源性为88.5%~99.1%。12个样本PEDV的S1基因序列与国内参考毒株核苷酸的同源性为91.0%~99.9%,氨基酸的同源性为88.5%~99.7%。与国外参考毒株核苷酸的同源性为89.0%~99.7%,氨基酸的同源性为86.5%~99.4%。与经典毒株CV777的核苷酸同源性为91.0%~100.0%,氨基酸的同源性为88.3%~99.9%。其中,仅GD-HY的S1基因与CV777的同源性达100.0%,其他同源性较低。表明近年广东省的PEDV流行毒株以变异株为主,与疫苗株(CV777)的亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪“顽固性腹泻”疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析.结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7％～100.0％,氨基酸的同源性为94.7％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7％,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0％.M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8％～100.0％,氨基酸的同源性为94.8％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8％,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0％.4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远.     

6株猪流行性腹泻病毒N基因的克隆与分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,采用胶体金试纸条检测安徽省境内发生疑似猪流行性腹泻病的病猪粪便（2013—2017年）;对PEDV抗原阳性猪样品,利用RT-PCR方法扩增其PEDV N基因,并进行测序和序列分析。结果发现,经胶体金试纸条检测确认了6个猪流行性腹泻发病猪场;对来自该6个猪场的病料样品或病毒传代培养物进行RT-PCR扩增和测序,共获得6株PEDV流行毒株的N基因序列,其序列全长均为1 326 bp,将其分别命名为N12、N22、N32、N42、N52和N62。核苷酸同源性分析显示,6株PEDV分离株N基因之间序列同源性为94.8%~99.8%。其中,5株PEDV分离株（N12、N22、N32、N52和N62）与PEDV疫苗株、经典毒株、2011年之前的我国分离株（LZC、CHS）的同源性较低（94.1%~96.3%）,亲缘关系较远;与2011年后国内外PEDV分离株存在较高同源性（96.9%~99.2%）,亲缘关系较近;而N42正好相反。该研究表明,近年来安徽各地猪场以PEDV新变异毒株的流行为主。     

1株猪流行性腹泻病毒S基因的克隆及序列分析

本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。     

Genetic Variation Analysis of S Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Isolated in Shanxi Provine

In order to investigate the variation in S gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), the 4 strains of PEDV S gene nucleotide sequences were obtained, through RT-PCR amplification of tissue samples from Shanxi province. The obtained sequences and the deduced amino acid were analyzed and compared with the other published PEDV strains. Sequence analysis showed that compared with CV777 vaccine, there were 12 nucleotides insertions between 170 to 171 bp, 3 nucleotides insertions between 401 to 402 and 454 to 455 bp, 6 nucleotides deletion between 461 to 468 bp. The nucleotide and amino acid homologies were 99.2% to 99.8% and 98.6% to 99.7% respectively among 4 strains of PEDV S gene; Comparing with the strains isolated from China in 2011 to 2015, CV777 vaccine, attenuated DR13 and CV777, the nucleotide homologies were 95.0% to 98.5%,93.2% to 93.6%,92.1% to 92.9%,93.7% to 94.4%,respectively.The amino acid homology were 96.2% to 98.9%,91.9% to 92.9%,91.9% to 92.6%,92.9% to 94.0%, respectively. Phylogenetic analysis revealed that 4 strains of PEDV S gene belonged to the first group and had high correlative genetic relationship with the PEDV strains which isolated after 2010 in China, and had far correlative genetic relationship with the PEDV strains which isolated before 2010 in China, 2 strains of Japanese, 7 strains of South Korea, 2 vaccine strains. The results suggested that the prevalence of PEDV in Shanxi province had a more obvious variation. Therefore, it was necessary to develop a new vaccine to control the outbreak of PEDV.     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

2012年河南省猪流行性腹泻病毒分离株S1基因遗传变异分析

We designed and synthesized two pairs of specific primers amplified S1 gene by RT-PCR method to investigate the variation in S1 genes of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in 2012 in Henan.S1 genes of 5 PEDV strains were cloned and sequenced, and their phylogenetic trees were analyzed from different swine breeding farms. Sequences analysis showed that S1 genes shared 98.3% to 99.5% nucleotide identities and 97.1% to 98.9% amino acids homologies among five PEDV isolates. Compared with domestic landing PEDV from 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 98.0% and amino acid homologies were 85.3% to 98.7%. Compared with CV777, the nucleotide homologies were 88.7% to 89.1% and amino acid homologies were 87.3% to 88.4%. Homology analysis showed that S1 genes of 5 isolates shared the same genetic mutation, there were the same insertions and deletions. Compared with domestic mutant strains landed from 2011, there was no tendency. However, compared with CV777, there were three nucleotide insertions from 163 to 166 bp, nine nucleotide insertions from 173 to 174 bp, three nucleotide insertions from 405 to 406 bp and three nucleotide deletions from 463 to 464 bp. These insertions and deletions of nucleotides led to its corresponding changes in encoding amino acids. Phylogenetic analysis showed that S1 genes of 5 PEDV strains belonged to the third group. However compared with part of PEDV first group domestic mutant strains landed in 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 89.3% and amino acid homologies were 85.3% to 86.9%. CV777 was the second group. The results showed that S1 genes of PEDV prevalent strain exist in first and third groups, but mainly prevailing third group strains, the pathogenic and antigenic differences of these strains should be further studied.     

中国西南部分地区2020－2021年猪流行性腹泻病毒遗传变异分析

【目的】 了解中国西南部分地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因型及遗传变异规律。【方法】 对2020－2021年四川和云南不同地区来源的200份腹泻猪肛门拭子进行RT-PCR检测,对PEDV S和ORF3基因进行克隆测序,利用MegAlign软件进行变异性分析,采用Mega 7.0软件进行系统进化分析,采用RDP4软件进行基因重组分析。【结果】 在所有样本中PEDV总体阳性率为15.50%（31/200）,群体阳性率为100%（8/8）。检出的8株PEDV S基因和ORF3基因序列与已登录毒株相似性分别为90.5%~99.4%和92.9%~100%。对S基因的进化分析显示,8个PEDV流行株分布于G2a、G2b和G2c 3个亚群中。其中,四川SCWJSWUN02株与福建CH/FJXM/1/2012株遗传距离较近,云南YNKMSWUN01株与越南毒株单独聚为一支,表明当前西南地区PEDV的流行呈现出区域间传播的特征。与本地区近年流行毒株和常用疫苗株相比,其S蛋白氨基酸序列均存在不同程度的变异,但ORF3蛋白相对保守。部分毒株S蛋白存在连续氨基酸的插入或缺失,如在SCMYSWUN03株S蛋白59－62位氨基酸处发现4个氨基酸的缺失;在YNKMSWUN01株78－82位氨基酸处和84－88位氨基酸处分别有5个氨基酸插入和缺失。部分氨基酸突变位点存在于已鉴定的PEDV S蛋白受体结合中。此外,基因重组分析结果显示,SCMYSWUN03株可能发生了基因重组事件,概率为98.2%（P<0.01）。【结论】 本研究发现当前西南地区流行的PEDV毒株包括G2a、G2b和G2c 3个亚群,毒株基因型具有多样性,且不同毒株间的变异性较大,丰富了PEDV在四川和云南地区的分子流行病学调查资料,揭示了中国西南地区流行的8个PEDV毒株的分子遗传变异规律和进化特征,为本地区猪腹泻病防控措施的制定提供了理论依据。     

Cloning and Molecular Characterization Analysis of M Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

In order to study the porcine epidemic diarrhea (PED) epidemic situation recently,small intestine tissue from piglets suspected porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) were collected in this study. The PEDV M gene was amplified using RT-PCR method and the molecular characterization were analysed. The results showed that the ORF of M gene was 681 bp which encoded 226 amino acids. The percent identity of M gene amino acid between PEDV in this study and reference strains in GenBank were higher than 96.0%,and that with CH/SD-M/2012 strain was highest (96.9%).The phylogenetic tree based on the Neighbor-Joining (NJ) and Minimum-Evolution (ME) showed that the PEDV in this study was closely related to CH/SD-M/2012 strain which were belonged to the same evolutionary branch. The phylogenetic tree analysis illustrated that M gene of PEDV was relatively conservative. The results of homology modeling analysis found that crystal model of M protein was similar to coronavirus nsp14-nsp10 complex 5c8s.1 and NAD kinase Ⅰ 2i1w.1.B which shared 27.69% and 15.07% sequence similarity,respectively. The protein structure prediction analysis found seven α-helix structures located in 110 to 113,118 to 125,132 to 136,140 to 145,147 to 152,154 to 157 and 160 to 173 amino acid regions,and five ligand structures of zinc finger located in 98 to 100,102 to 107,135 to 137, 139 to 145 and 149 to 154, amino acid regions. The protein structure prediction analysis indicated that the M protein might be a polyprotein of viral genome replication enzyme.     

猪流行性腹泻病毒M基因克隆与分子特征分析

为更好地了解近年来中国暴发的猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）疫情,本研究采集荣昌及其周边地区疑似患有PED的猪小肠上皮组织进行RNA的提取,扩增猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）M基因序列,进行序列分析及M蛋白分子特性研究。结果显示,M基因开放阅读框（ORF）长为681 bp,编码226个氨基酸。通过DNAMAN软件及系统进化树分析发现,本试验中PEDV与GenBank中参考毒株的M基因氨基酸同源性在96.0%以上,其中与广东毒株CH/SD-M/2012株亲缘关系最为相近,同源性高达96.9%,表明M基因相对比较保守。通过M蛋白同源建模及功能预测发现,M蛋白晶体模型同SARS冠状病毒nsp14-nsp10复合体5c8s.1.A及NAD激酶Ⅰ2i1w.1.B模型序列相似性为27.69%、15.07%;其高级结构中在第110-113、118-125、132-136、140-145、147-152、154-157、160-173位氨基酸处存在7个α螺旋,在第98-100、102-107、135-137、139-145、149-154氨基酸存在5个锌指结构配体,M蛋白为PEDV病毒基因组复制酶的多聚蛋白。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。