湖北省首例山羊小反刍兽疫疫情诊断

2014年3月底湖北省恩施州鹤峰县养羊户从外省购入山羊后,山羊出现发热、咳嗽、流涎、腹泻等小反刍兽疫疑似症状。采集3只病死山羊病料、8只发病山羊棉拭子和8份血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用阻断ELISA试剂盒对8份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性;利用小反刍兽疫病毒特异性荧光定量R T-PCR方法,从11只病羊样品中均检测到小反刍兽疫病毒核酸,结果经国家外来动物疫病研究中心复核确认,确诊为湖北省首例山羊小反刍兽疫疫情。     

小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的病毒分布

为了解小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的分布情况,平行采集临床发病羊的脾脏、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、大肠、淋巴结以及眼拭子、鼻拭子、肛门拭子、血清等样品,应用荧光RT-PCR方法对各样品进行平行检测,比较各样品检测Ct值,评估病毒分布和各样品中的病毒含量,结果显示,所有样品小反刍兽疫病毒核酸均为阳性,其中大肠、肺脏、脾脏和淋巴结的检测Ct值较小,表明小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内呈全身分布,但在大肠、肺、脾和淋巴结等组织中的含量较高。     

应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒

为适应小反刍兽疫快速、准确、高通量诊断的需求,建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的小反刍兽疫病毒鉴定方法。对Gen Bank中已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序,测得序列经比对分析可以确定是否为小反刍兽疫病毒感染。采用所建立的PCR-焦磷酸测序方法对西藏采集的10份血清样品进行检测,检测结果表明,该方法可以用于小反刍兽疫病毒的检测,而且该样品可初步鉴定为疫苗株感染。     

新疆小反刍兽疫疫情诊断

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情,根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测,结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒,在11只病羊样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT-PCR反应,从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较,结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析,该病原属于谱系4,与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。     

2017年—2021年常德市小反刍兽疫监测分析

2017年—2021年,笔者对常德市114个羊场采集的拭子样品和257个羊场采集的血清样品分别进行了小反刍兽疫病毒检测及免疫抗体检测,结果显示2593份拭子样品未检出小反刍兽疫病毒核酸,3320份血清样品免疫抗体合格率为93.64%。     

小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。     

小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒多重荧光RT-LAMP鉴别检测方法的建立及应用

旨在建立一种可视化多重荧光RT-LAMP方法用于检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的核酸,并初步应用于小反刍兽疫和蓝舌病临床样品的检测。比对GenBank中小反刍兽疫N基因和蓝舌病NS3基因保守区域,设计2套LAMP引物,在每条内引物FIP的5′端标记荧光基团。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和干扰性,同时应用该方法检测168份临床样品。结果表明,该方法对小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒高度特异,与口蹄疫病毒、鹿流行性出血热病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反刍动物病毒均无交叉反应,检测灵敏度为200 copies/μL,干扰性小,可同时检测两个不同浓度的模板。对168份样品的检测结果显示,小反刍兽疫病毒的感染率为3.6%,蓝舌病病毒的感染率为13.1%,无两种病毒混合感染;与荧光RT-PCR方法相比,此多重荧光RT-LAMP方法敏感性为91.7%～100%,特异性为100%。表明建立的多重荧光RT-LAMP可快速、准确地检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒,具有较好的临床应用价值。     

浏阳市规模羊场小反刍兽疫流行情况和抗体水平分析

为做好浏阳市小反刍兽疫的专项防控工作,掌握浏阳市小反刍兽疫的流行情况和抗体水平,分析评估疫情风险,为动物疫病防控和养羊产业健康发展提供有效的技术支撑。随机抽取全市存栏50只以上的规模羊场,采集羊眼-鼻拭子样品和血清样品,采用竞争ELISA和荧光RT-PC R方法分别进行抗体水平检测和病毒核酸检测。结果显示：本次共检测规模羊场41家,累计检测血清样品808份,羊眼-鼻拭子样品1,352份,平均抗体水平为60.02%,其中25个羊场的抗体水平高于农业农村部最低标准70%,16个羊场的抗体水平低于70%;所有规模羊场的拭子样品均未检出小反刍兽疫病原核酸。结果表明：浏阳市小反刍兽疫疫情的防控效果较好,但整体抗体水平较低,养殖场需加强羊场的小反刍兽疫的免疫,确保全年不发生疫情。     

羊肠道病毒与小反刍兽疫病毒混合感染及流行病学调查

本实验室2014年从吉林省某地暴发严重腹泻的病羊群分离出肠道病毒(CEV-JL14)和小反刍兽疫病毒,表明这2种病毒在该次疫病的暴发中可能发挥重要作用。为进一步了解羊群中小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染情况,本研究应用建立的检测小反刍兽疫病毒抗原的夹心ELISA试剂盒和检测羊肠道病毒抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒,对采自吉林省和内蒙古地区的共计1 167份羊粪便分别进行检测,发现被检羊群存在较为严重的小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染。羊群混合感染小反刍兽疫病毒和羊肠道病毒在国内外属首次报道,该发现为今后上述病毒引起的疫病的诊断、防治提供流行病学理论依据。     

小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。