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1.
《中国兽医学报》2016,(3):395-400
为研究猪CD74分子特性和功能,应用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA Ends)技术从猪脾脏细胞中克隆了完整的猪CD74基因。根据已知的部分CD74基因保守区序列,自行设计1对简并引物,扩增CD74较为保守的部分基因片段,根据测序结果设计系列引物扩增CD74基因,最后根据全基因测序结果设计1对特异性引物扩增猪CD74全长基因。分析和比对测序结果显示,完整的猪CD74基因全长存在1 145、1 337nt 2种类型,对应编码阅读框为651、843nt,分别编码217和281个氨基酸,提示猪CD74存在2种异构体结构。氨基酸序列研究表明,猪CD74与其他物种的CD74分子存在类似的胞浆区、跨膜区、内质网区和甲状腺区等功能区,存在L7I8和P15M16L17两个内体定位基元,内质网区包含CLIP区和三聚体区等结构域,异构体1 337nt较1 145nt多了编码64个氨基酸的Tg区。遗传进化分析显示,猪CD74与哺乳类物种间存在较高同源性,可达57%~82%,与禽类的CD74同源性为45%~51%,与鱼类、爬行类物种同源性最低仅为25%~34%。3D模拟结构显示,猪CD74与小鼠、人及禽类CD74存在类似的结构域,其中在一些关键部位氨基酸基本相同。  相似文献   

2.
试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。  相似文献   

3.
亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。  相似文献   

4.
从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。  相似文献   

5.
为了研究陆川猪HSP27基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR和克隆方法,扩增了HSP27基因的编码区序列,并进行了测序和序列分析及其蛋白质结构预测。结果表明:陆川猪HSP27基因编码区全长624 bp,编码207个氨基酸;与Gen Bank中已发表的猪HSP27基因序列相比,核苷酸有1个位点发生碱基突变,但并未引起相应氨基酸的改变;陆川猪HSP27成熟肽包含α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲;陆川猪HSP27基因与野猪的亲缘关系最近。  相似文献   

6.
猪DECR1基因cDNA的克隆、序列分析及原核表达研究   总被引:2,自引:1,他引:1  
旨在研究猪2,4-dienoyl-CoA reductase1(DECR1)基因的结构,揭示该基因的原核表达规律。试验以山西马身猪的肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术克隆了DECR1基因的cDNA全序列,并将其重组于pET32a+原核表达载体中,经酶切、序列鉴定正确后,重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。结果表明:猪DECR1基因的cDNA全长2352bp,包括987bp的开放阅读框(ORF),53bp的5′非翻译区(UTR)和1312bp的3′-UTR;编码区(CDS)编码328个氨基酸残基与猪(电子预测序列)、牛、人、猩猩、猴、马、犬、鼠相应序列的同源性分别为99%、88%、88%、87%、87%、87%、87%和83%;SDS-PAGE电泳结果显示,在IPTG诱导4h时,外源蛋白表达效率最高;Western blot检测发现经诱导表达的蛋白产物大小约为35ku,与预测的大小一致。猪DECR1基因的克隆和表达研究,为进一步探究该基因的生物学功能及其分子遗传机制提供了理论基础。  相似文献   

7.
运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段.  相似文献   

8.
旨在克隆荣昌猪TMSB15A基因全长,检测该基因在荣昌猪各组织中的表达特征,并对其基因的结构与功能进行分析。本研究利用RCAE(Rapid-amplification of cDNA ends)-PCR以及RT-PCR(Real-time quantitative PCR)技术克隆荣昌猪TMSB15A基因mRNA全长序列以及检测该基因在荣昌猪各组织中的表达特征。结果表明,荣昌猪TMSB15A基因全长654bp,其中CDS区长138bp,编码45个氨基酸,5′UTR和3′UTR分别长86和430bp。生物信息学分析表明,TMSB15A蛋白的理论分子量为5.2ku,有10个带负电的氨基酸,9个带正电的氨基酸,蛋白理论等电点为5.3;预测TMSB15A蛋白无疏水区、信号肽结构、跨膜结构域,其主要在细胞质中发挥生理功能;TMSB15A蛋白的三级结构由α-螺旋和无规则卷曲构成。TMSB15A基因编码的氨基酸序列与人、长臂猿以及黑猩猩的同源性最高,为97.8%,其次是骆驼和兔,为93.3%,与马的同源性最低,为11.1%。TMSB15A在荣昌猪免疫相关组织脾和胸腺中表达量最高(P0.01),在淋巴结和肺中呈中等丰度表达,在心、肝、肾和肌肉中表达量较低。本试验为研究TMSB15A基因的功能奠定了基础,也为荣昌猪抗病育种研究提供了理论支撑。  相似文献   

9.
分离昆明小鼠与BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞,经Con-A活化,提取细胞总RNA,RT-PCR获得小鼠Ii分子(P31、P41)基因,DNAStar软件分析序列。将BALB/c小鼠P31/P41分子插入到pGEX-KG多克隆位点构建原核表达载体,IPTG诱导并经GST标签蛋白纯化柱纯化表达蛋白,将GST-P31/P41蛋白分别与弗氏佐剂混合乳化后免疫家兔,采集血清。测序分析显示,两品系小鼠P31、P41均分别为648、840bp,编码215个、279个氨基酸;序列比对结果表明,昆明小鼠、BALB/c小鼠P31、P41分子与GenBank已登录核苷酸序列与/或氨基酸序列均存在多个位点差异,且所克隆的两品系小鼠P31分子之间核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸序列同源性为98.6%;两种小鼠P41分子之间核苷酸序列、氨基酸序列同源性均为99.3%;通过与人、鸡对应Ii分子进行比较,发现与人同源性较高,核苷酸序列同源性在79.0%以上,氨基酸序列同源性在73.0%以上,而与鸡同源性相对较低,核苷酸序列同源性在55.0%以上,氨基酸序列同源性在41%以上。IPTG诱导并纯化后获得GST-P31/P41蛋白,免疫家兔后所采集的血清经ELISA、Western-blotting证实获得了兔抗P31/P41多克隆抗体。结果表示,昆明小鼠与BALB/c小鼠Ii分子间存在差异位点,并成功制备了兔抗Ii分子多克隆抗体,为开展靶向性表位疫苗研究奠定基础。  相似文献   

10.
为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。  相似文献   

11.
本研究旨在探明鸡恒定链(invariant chain,Ii)与内吞体转运蛋白Rab5a和Rab7b结合的结构域和在细胞内共定位的特征。首先,用PCR和基因突变技术将Ii胞浆区与跨膜区[Ii(Cyt-Tra)]、Ii CLIP (class Ⅱ-associated invariant chain peptide)-三聚体区[Ii(CLIP-TRIM)]和Ii突变体[Ii(M81-87aa)、Ii(M91-99aa)和Ii(M81-99aa)]分别插入pET-32a和pEGFP-C1构建相应的原核和真核重组质粒。其次,将构建的含有绿色荧光蛋白的重组质粒与实验室保存的含有红色荧光Rab5a和Rab7b的重组质粒共转染至人胚胎肾细胞系293 T,观察它们的共定位。将构建的原核重组质粒进行表达和纯化,最后用拉下法和免疫印迹检测Ii与Rab5a和Rab7b的结合域。结果表明,成功构建Ii结构域及Ii突变体的重组质粒。Ii(Cyt-Tra)及Ii突变体均能与Rab5a和Rab7b在细胞内共定位,而Ii(CLIP-TRIM)与空载体却不能。Ii的胞浆区和跨膜区是与Rab5a和Rab7b结合的功能结构域,而不是CLIP与三聚体区。综上所述,鸡Ii与Rab5a和Rab7b共定位和结合的区域是其胞浆区和跨膜区,而不是内质网腔区。这些结果提示Rab分子参与了Ii在胞内细胞器的转运机制,为进一步研究Ii及其载体在细胞内的转运机制和功能提供了新的途径。  相似文献   

12.
采用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后不同时相猪肺泡巨噬细胞(PAM)中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DR、Ii链和SLA-DM分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的mRNA转录动态进行了定量检测。结果表明,PRRSV感染后PAM的SLA-DR mRNA转录水平在3、7和14 d下调,低于对照组;感染后3 d,Ii链、SLA-DM和CD40的mRNA转录水平极显著下调(P〈0.01);CD80和CD86mRNA转录水平也在感染后3 d明显下调(P〈0.05)。用流式细胞术检测PAM表面的SLA-DR抗原的结果表明,在感染后3 d短暂上升,7 d之后一直低于对照组。由此说明,PRRSV感染早期对猪肺泡巨噬细胞的外源性抗原加工和递呈功能产生显著影响,导致其外源性抗原递呈功能下降,进而影响机体的体液免疫应答。  相似文献   

13.
鸡Rab7b在细胞晚期内吞体定位和结合恒定链的分子特征   总被引:1,自引:1,他引:0  
Rab蛋白是介导胞内活性蛋白转运的分子家族。恒定链(invariant chain,Ii)具有协助抗原肽转运、B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能。前期研究发现,鸡(Gallus gallus)Rab5a在细胞早期内吞体中与Ii结合,但不清楚是否还有其他转运蛋白有该特性。基于Rab7b分子定位于晚期内吞体,并与胞内分子转运相关,本研究探索了鸡Rab7b与Ii结合的分子结构特征。首先,用自行设计的引物扩增了鸡和小鼠(Mus musculusRab7b基因,并进行了氨基酸同源性比对分析;构建了含鸡Rab7b及其67位氨基酸突变体Rab7bQ67L的原核和真核重组质粒。其次,将含红色荧光蛋白和目的基因的重组质粒转染鼠巨噬细胞系Raw264.7,培养后用绿色荧光素(FITC)标记的鼠抗晚期内吞体蛋白1(LAMP1)抗体染色,观察目的蛋白在内吞体的定位。进一步将鸡Rab7b和Rab7bQ67L分别与Ii共转染293T细胞,观察它们与Ii的共定位。最后用拉下法和免疫印迹检测鸡Rab7b及Rab7bQ67L与Ii的结合。结果表明,所克隆获得的鸡Rab7b基因与预期大小一致,其开放阅读框为624 bp,编码208个氨基酸。鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构相似性为74%。尽管鸡Rab7b和突变体Rab7bQ67L均能结合Ii,但只有Rab7b可以定位于晚期内吞体,而突变体却改变了该定位特性。综上所述,鸡Rab7b与Ii不仅在晚期内吞体共定位,而且还能互相结合;鸡Rab7b的第67位氨基酸影响其在细胞内定位而不影响与Ii结合。综上表明,Rab分子参与了Ii在细胞内细胞器的转运,为进一步研究Ii在细胞内的转运机制提供了新的途径。  相似文献   

14.
Rab is a family of molecules that mediate the transport of active proteins in cells. The invariant chain (Ii) has the immunological functions of assisting antigen peptide transport, B cell maturation, and acting as the receptor of cytokines. Previous studies showed that Rab5a of chicken (Gallus gallus) is bound to Ii in the early endocytosis, but it is not clear whether there are other Rab molecules with this property. Based on the localization of Rab7b in late endocytosis and its relationship with intracellular molecular transport, this study explored the molecular structure of Rab7b binding to Ii. First, Rab7b genes of chicken and mouse (Mus musculus) were amplified with self-designed primers, and the amino acid homology was analyzed; the prokaryotic and eukaryotic recombinant plasmids containing Rab7b and its 67 amino acid mutant Rab7bQ67L were constructed. Secondly, the recombinant plasmid containing red fluorescent protein and target gene was transfected into mouse macrophage line Raw264.7. After culture, the recombinant plasmid was stained with FITC labeled mouse anti late endosomal protein 1 (LAMP1) antibody to observe the localization of the target protein. Furthermore, chicken Rab7b and Rab7bQ67L were co-transfected with Ii to observe their co-localization with Ii. Finally, the binding of Rab7b and its mutants to Ii were detected by pull-down technique and Western blotting. The results showed that the Rab7b gene was the same size as expected, and its open reading frame was 624 bp, encoding 208 amino acids. The homology of Rab7b protein structure between chicken and mouse was 74%. Although both Rab7b and Rab7bQ67L could bind to Ii, it was Rab7b rather than Rab7bQ67L could locate in the late endocytosis. In conclusion, Rab7b and Ii were not only co-located in the late endocytosis, but also combined with each other; the 67th amino acid of Rab7b affected its location in cells but not with Ii. These results suggest that Rab molecules are involved in the transport of Ii in intracellular organelles, which provides a new way to further study the mechanism of Ii transport in cells.  相似文献   

15.
为了解贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株的遗传变异情况和分子流行病学背景,本研究收集了2007年以来贵州省不同地区的12株PRRSV,并对其Nsp2基因进行序列测定与遗传变异分析。结果表明,该12株PRRSV均与我国2006年以来流行的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)位于进化树的同一分支中。8株PRRSV的Nsp2蛋白存在第481位和533位~561位共30个氨基酸的不连续缺失,这与以往报道的HP-PRRSV的缺失特征相同;另外4株PRRSV缺失扩大,其中的3株在第481位氨基酸的两翼又缺失了29个氨基酸,即471位~500位氨基酸缺失;另外1株除第481位和533位~561位氨基酸缺失外,在第394位缺失1个氨基酸。这些新缺失毒株的出现,显示HP-PRRSV可能出现了新的变异走向。为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。  相似文献   

16.
Molecular cloning and mRNA expression of duck invariant chain   总被引:3,自引:0,他引:3  
  相似文献   

17.
用RT—PCR从经ConA刺激的马外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出马白细胞介素18(Equine interleukin-18,EIL-18)前体蛋白(precursor EIL-18,pEIL-18)基因的cDNA,然后克隆至载体pCR2.1-TOPO中,鉴定并命名为pCR2.1-pEIL-18。自pCR2.1-pEIL-18中扩增马白细胞介素18成熟蛋白(mature EIL-18,mEIL-18)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并纯化其表达产物。结果表明,mEIL-18基因全长474bp,含1个开放阅读框,编码157个氨基酸的成熟蛋白;表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,经SDS-PAGE和Western—blot分析,重组蛋白相对分子量约为20ku,且具有免疫生物学活性。mEIL-18基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下采用Ni^+亲和层析纯化方法获得了高纯度的重组mEIL-18,为探究马白细胞介素18的生物学活性及其应用奠定了基础。  相似文献   

18.
应用RT-PCR技术从猪肾脏中扩增到猪前胸腺素基因,测序结果表明,猪前胸腺素完整开放阅读框(ORF)共333 bp,编码109 aa,与已公布的2个猪前胸腺素基因核苷酸同源性均为99.4%.构建了重组质粒pET-32-mProTα,并转化大肠杆菌(E.coli)Rosetta 2(DE3).SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达产物约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为12.07 ku.MTT法试验证实,表达产物初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞的增殖.  相似文献   

19.
跨膜糖蛋白恒定链在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(Ii-Key)在此过程中发挥重要作用。为了研究Ii-Key携带异种病毒抗原表位能否有效增强机体的免疫应答,本试验首先构建Ii-Key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位(aa197-209)和新城疫病毒HN肽表位(aa345-353)的嵌合体,并将嵌合体基因插入pET-32α原核表达载体,转化E.coli Rosetta诱导表达,用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫SPF级BALB/c小鼠,分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明,与VP2/HN串联表位对照组相比较,Ii-Key/VP2/HN嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。通过将嵌合体基因导入pmCherry-C1真核表达载体与pEGFP-N1-MHCⅡα共转染293T细胞,结果表明Ii-Key/VP2/HN嵌合体与VP2/HN和空载体蛋白在细胞内均呈现弥散状,与MHCⅡ类分子共定位无明显差异。综上所述,Ii-Key能够携带异种病毒串联抗原表位有效增强免疫应答,其增强机制还有待于进一步研究。  相似文献   

20.
猪缝隙连接蛋白43(GJA1)结构和功能的预测与分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
为了探究猪缝隙连接蛋白43(GJA1)的结构和相关功能,本研究对16个哺乳动物的GJA1蛋白进行多重序列比对及系统发育分析,并通过相关的生物信息学数据库和软件从理化性质、蛋白修饰位点、跨膜区、亚细胞定位、二级结构、三级结构、多态位点、功能区域和互作蛋白等方面对猪GJA1蛋白的结构和功能进行系统分析。系统发育分析结果显示,GJA1蛋白在16种哺乳动物中变异未达到饱和,物种间遗传距离小且同源性高,其中猪与马的GJA1蛋白序列最为接近,同源性达93.3%,在进化树上的分类也证实了这一结果。蛋白结构分析结果显示,猪GJA1蛋白分子质量为43.08 ku,理论等电点为8.88,由20种氨基酸组成,不稳定指数为44.06,平均疏水系数为-0.240,脂溶指数为82.67,不分泌信号肽,有4个跨膜区、6个O-糖基化位点和38个磷酸化位点,最有可能位于细胞质膜和高尔基体内,其二级结构和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。蛋白功能分析结果显示,在猪GJA1蛋白的CDS序列中有2个超级家族结构功能区域和6个错义突变位点,且猪GJA1蛋白还与ZO-1和Cx36等蛋白及多种蛋白激酶存在相互作用。本研究通过生物信息学分析系统地揭示了猪GJA1蛋白的结构和功能,为后续进一步研究GJA1蛋白在猪体内发挥生物学功能的遗传调控机制提供一定的理论支持。  相似文献   

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