番茄细菌性溃疡病菌的实时荧光PCR检测

 由Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Cmm)引起的番茄细菌性溃疡病是一种严重危害番茄生产的种传细菌性病害。根据ITS序列多态性设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR检测的结果表明,这组引物一探针能检测出所有供试的Cmm菌,对照菌均未检测到荧光信号。用接种但未显示症状的番茄苗叶片及人工处理的带菌种子提取的核酸作为模板,均能检测到病菌,其检测灵敏度比常规PCR高约100倍。实验中不需病原菌的分离培养及PCR的后续处理。该方法快速、简便、安全、准确,适用于出入境检验检疫及种子、种苗健康检测领域。     

玉米细菌性枯萎病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

成功建立了玉米细菌性枯萎病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法.该方法根据细菌16S rDNA序列的特异性,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变特异性探针,并对10种细菌菌株和5种植原体进行了实时荧光PCR.结果表明,只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光信号,而其它参考菌不产生荧光信号,检测的绝对灵敏度是14.2 fg/μl质粒DNA,比常规的PCR电泳检测高约100倍.整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无须PCR后处理.     

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。      

利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道.本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生.与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用.经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法.     

柑桔溃疡病菌实时荧光定量PCR检测与应用

根据地毯草黄单孢Xac306菌株(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac306)已知全基因组中独有蛋白基因序列设计的特异性引物对和探针,建立并优化SYBR Green I(SGI)荧光染料和Taq-Man探针实时荧光定量PCR检测体系,用于柑桔溃疡病早期诊断鉴定。结果表明,建立的两种定量PCR体系均能特异地检出Xac的细胞和其基因组DNA,而对其它测试的植物病原菌和柑桔表面的腐生黄单孢菌都不能检出。SGI法和TaqMan探针法对Xac细菌悬浮液的检测灵敏度均可达到1~5个细菌/反应,对Xac靶标片段DNA的检测灵敏度可达1fg/μL。两种定量PCR检测方法比常规PCR灵敏度高2~3个数量级。对田间采集的328个柑桔显症、疑似症状和无症带菌材料富集培养样品进行了实际检测,结果表明,实时荧光PCR适合柑桔无症带菌样品的早期检测。     

苜蓿萎蔫病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物，目前国内尚无发生6在出入境捡验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测，劳动强度大，耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突交特异性探针，利用该探针对棒形杆菌属4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号，其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强，灵敏度高，能检测到21．4fg质粒DNA，比常规PCR灵敏100倍，而且整个过程只需要2～3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。     

大豆茎溃疡病菌TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测

 The technique of TaqMan MGB real-time fluorescent PCR was established to detect Diaporthe phaseolorum var.caulivora (DPC) and D. phaseolorum var.meridionalis (DPM). The primers and TaqMan MGB probes were designed based on the ITS of DPC, DPM, D. phaseolorum var. sojae and Phomopsis longicolla. A series of genomic DNA dilution were used to detect sensitivity of the technique, the results showed that the limits of detection for DPM and DPC were 7 fg/μL and 6 fg/μL DNA respectively.     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法

油棕猝倒病菌(Pythiums plendens)是我国进境植物检疫性有害生物。本试验根据P.splendens rDNA ITS区序列,设计了实时荧光PCR引物pyspF/pyspR及荧光探针pyspT,建立了P.splendens荧光PCR检测方法,检测灵敏度为0.012pg/μL。     

油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测

 根据油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans与其近似种ITS序列的差异,设计了检测L. maculans的引物Lmb3/R2和探针Probe-M,建立了L. maculans的实时荧光PCR检测方法。试验结果表明,来自加拿大、澳大利亚和乌克兰等国的22株L. maculans菌株都能得到阳性扩增,而供试的30株L. biglobosa菌株和6株其他菌株以及空白对照没有荧光信号的增加。该检测方法的灵敏度达到4 pg菌丝DNA,整个检测过程控制在4 h内,其快速、特异和灵敏的特点可以满足进境油菜籽样品的快速初检以及病菌分离物的快速鉴定。     

番茄溃疡病菌PCR快速检测技术

番茄溃疡病是一种严重危害番茄生产的细菌性病害，许多国家将其列为检疫性病害。利用ITS通用引物扩增了番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）的ITS序列，并进行克隆测序。根据序列比较结果设计了引物BT1和BT2，该引物特异性好，能专一扩增出268bp电泳条带，而马铃薯环腐病菌等不同亚种、不同属的细菌及健康的番茄材料均无扩增条带。从接种但未显症番茄苗叶片及人工模拟染菌种子上提取总DNA，以此为模板均能稳定地扩增出特异性目的条带。该方法直接对种子或植株进行检测，不需进行病原菌分离培养，快速简便，适用于出入境检验检疫及种苗健康检测领域。     

PCR技术快速检测玉米内州萎蔫病菌研究

玉米内州萎蔫病是北美玉米生产中的严重病害,为防止其传入我国,本研究采用Clavibacter michiganensis不同亚种的转录间隔区序列,设计了特异性的PCR引物,对C.michiganensis种下不同亚种的DNA进行了PCR扩增反应,结果表明,只有玉米内州萎蔫病菌的特异性扩增得到大小为170bp的目标片段,且仅有此一条明显的PCR扩增产物,C.michganensis种下其他亚种无扩增产物。PCR反应的灵敏度为4.36×105cfu/mL和1.56×102pg,可以满足检疫的要求。     

种传番茄溃疡病菌直接PCR和免疫捕捉PCR检测方法之比较

用PBS和种子研磨后的普通病原提取液稀释番茄溃疡病菌纯菌液,并以梯度纯菌液和带菌种子提取液作为模板进行直接PCR和免疫捕捉PCR,比较2种方法在纯菌液和带菌种子提取液中的检测灵敏度,找到一种高特异性、高灵敏度、简便快捷的方法用于检测番茄种子携带的番茄溃疡病菌。结果显示在纯菌液中直接PCR灵敏度为104cfu/mL,免疫捕捉PCR为102cfu/mL;在带菌种子提取液中直接PCR灵敏度为106cfu/mL,免疫捕捉PCR为104cfu/mL;免疫捕捉PCR比直接PCR灵敏度高100倍,尤其在实际种子检测中优势更明显,而且检出时间短,重复性好。     

双重PCR检测马铃薯晚疫病和环腐病方法的建立

通过克隆马铃薯环腐病菌和晚疫病菌转录间隔区(ITS)序列,并对测序结果进行同源性比较,选取差异位点分别设计了两对引物P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2,并检测了引物的特异性及方法的灵敏度。引物P.IN1/P.IN2可扩增出1条363bp马铃薯晚疫病菌的特异性条带,在DNA水平上其灵敏度达18fg/μL;引物C.IN1/C.IN2可扩增出1条218bp马铃薯环腐病菌的特异性条带,在细菌数上检测灵敏度为104 cfu/mL。混合这两对引物构建双重PCR反应体系,能从马铃薯环腐病菌和晚疫病菌的混合DNA及感染这两种菌的马铃薯植株中同时扩增到363bp和218bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和环腐病菌的快速可靠检测。     

Quantification of viable cells of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis using a DNA binding dye and a real-time PCR assay

Viable cells of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (CMM), the causal agent of bacterial canker of tomato, were discriminated from the dead cells by quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), after the bacterial solution was treated with the DNA binding dye ethidium monoazide (EMA). The primers and TaqMan probe, based on the 16S-23S rDNA spacer sequences, were highly specific for CMM at the subspecies level. The detection limit of the direct real-time PCR was 10³ colony forming units per mL (cfu mL⁻¹) in samples and with an apparent sensitivity of 2 cfu of target cells in PCR reaction solution. Application of this method allows for selective quantification of viable cells of CMM and facilitates monitoring the pathogen in tomato seeds.     

不同来源番茄溃疡病菌致病力差异研究

采用打顶法接种、半选择性培养基再分离发病植株中的病原菌,以及特异性PCR验证方法,对来自3个国家9个不同地区的46株番茄溃疡病菌进行了致病性测定,以病情指数评价不同菌株的致病力。结果显示,分离自我国河北滦平县、内蒙古包头市等地的24株菌株的病情指数达到75以上,属于强致病力水平;11株菌株的病情指数为50~75,属于中等致病力;而9株菌株的病情指数为50以下,属于弱致病力;检测同时证实,有2株属于无致病力菌株。强致病力、中等致病力、弱致病力和无致病力菌株占供试菌株总数的比例分别为52.2%、23.9%、19.6%和4.3%,表明供试的46株番茄溃疡病菌存在不同程度的致病力差异。