利用PCR法鉴定产SLT-IIe大肠杆菌

类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体（ Ｓｈｉｇａｌｉｋｅ Ｔｏｘｉｎ Ⅱ Ｖａｒｉａｎｔ, Ｓ Ｌ ＴⅡｖ ｏｒ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ）,是仔猪水肿病的主要致病因子。根据 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 基因序列,合成一对针对 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 操纵子基因保守区的寡核苷酸引物,建立了聚合酶链式反应（ Ｐ Ｃ Ｒ）扩增方法。通过对产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 毒素大肠杆菌菌株 Ｔ Ｂ１、产 Ｓ Ｌ ＴⅡ毒素大肠杆菌菌株 ９３３ Ｗ 和产 Ｓ Ｌ ＴⅠ毒素大肠杆菌菌株 Ｈ３０ 的试验,结果表明用所设计的引物建立的 Ｐ Ｃ Ｒ方法可特异性鉴定产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 大肠杆菌。用此法对本实验室从患水肿病仔猪肠道分离的 １５ 株大肠杆菌进行了鉴定,结果可从 １５ 个菌株的 １２ 株中扩增到 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 的特异性保守序列基因片段,而其它菌株未见此保守序列的基因片段。     

聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素基因

两对寡核苷酸引物通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素Ｉ（ＳＬＴ Ｉ）和志贺样毒素Ⅱ（ＳＬＴⅡ）基因,在单一反应中,两对引物分别扩增出１３０ｂｐ（ＳＬＴⅠ）和３４６ｂｐ（ＳＬＴ Ⅱ）的ＤＮＡ 片段,扩增片段经地高辛标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交分析,证实为ＳＬＴ Ⅰ和ＳＬＴ Ⅱ基因产物。同一扩增反应中应用ＳＬＴⅠ和ＳＬＴⅡ复合引物进行扩增,不同基因型志贺样毒素大肠杆菌从样品中鉴定出。８６９份牛、猪腹泻粪样ＤＮＡ 样品通过ＰＣＲ进行了测定,其中,３％ 检出志贺样毒素大肠杆菌,与牛出血性腹泻、猪水肿病有关。     

用基因修饰的Ⅱ型变异类志贺氏毒素免疫预防猪水肿病

猪水肿病是由产Ⅱ型变异类志贺氏毒素（ＳＬＴ－Ⅱｖ）的埃希氏大肠杆菌所致。基因修饰的ＳＬＴ－Ⅱ，（Ｅ１６７Ｑ）对猪无毒性，并能使猪产生抗ＳＬＴ－Ⅱ抗体。在１和２周龄对哺乳仔猪免疫５０μｇＥ１６７Ｑ断奶后（３～４周龄）对免疫猪和非免疫猪口服接ＳＬＴ－Ⅱ）的埃希氏大肠杆菌，饲喂低蛋白的非免猪表现为亚临床症状，组织学变化为血管损伤，饲喂高蛋白日粮的非免猪出现临床水肿病，表现为明显的血管损伤，增重下降，共     

聚合酶链反应扩地大肠杆菌志贺样毒素基因

两对寡核苷酸经物通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素Ⅰ（ＳＬＴⅠ）和志贺样毒素Ⅱ（ＳＬＴ Ⅱ）基因,在单一反应中,两对引物分别扩增出１３０ｂｐ（ＳＬＴⅠ）和３４６ｂｐ（ＳＬＴⅡ）的ＤＮＡ片段,扩增片段经地高辛标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交分析,证实了ＳＬＴⅠ和ＳＬＴⅡ基因产物。     

志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得１株针对志贺氏菌样素Ⅱ为异体９Ｓｈｉｇａ－ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ Ⅱ ｖａｒｉａｎｔ,ＳＬＴ－Ⅱｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞,并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株,发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应,与产ＳＬＴ－Ⅱ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应,但与产ＳＬＴ－Ⅰ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ     

猪水肿病菌株毒素的抽提、鉴定和产毒量比较

对分离自江苏、上海等地的１５株仔猪水肿病菌株进行了毒素抽提，细胞毒性和动物试验鉴定结果表明，其中１４株能产生水肿病毒素（ＳＬＴ－Ⅱｖ），说明水肿病的发生与毒素密切相关。本文比较了这些菌株的产毒量，筛选出４株高产毒素菌株。     

引致猪水肿病毒素的抗体检测

猪水肿病（ＥＤ）是断奶仔猪常见的一种传染病，与类志贺氏毒素Ⅱ变种（ＳＬＴ－Ⅱｖ）密切相关。本试验用多粘菌素Ｂ从基因工程菌大肠杆菌ＴＢ１中提取ＳＬＴ－Ⅱｖ，作中和试验检测来自江苏等地２６７份屠宰猪血清，发现９份血清有ＳＬＴ－Ⅱｖ的抗体，滴度由１∶４～１∶２５６不等，显示致猪水肿病毒素在猪群的实际存在     

仔猪的水肿病

仔猪水肿病发生于断奶后１－３周仔猪，发病率３０－４０％，死亡率４０％，是水肿病大肠杆菌１０７／８０菌株所致。该菌粘附于小肠粘膜，在此繁殖、产生神经血管毒素ＳＬＴ－ⅡＶ，引起小动脉退行性变化、水肿、浸润、凝血、坏死、血栓形成。脑和脊髓因血管病变而组织软化。临床表现为突然死亡和内毒素休克症状，之后发育迟缓。推荐用ＳＬＴ－ⅡＶ的无毒性突变体和粘附因子Ｆ１０７相结合的疫苗防制该病。     

猪水肿病毒株毒素的抽提,鉴定和产毒量比较

对分离自江苏，上海等地的１５株仔猪水肿病毒株进行了毒素抽提，细胞毒性和动物试验鉴定结果表明，其中１４株能产生水肿病毒素（ＳＬＴ－Ⅱ）说明水肿病的发生与毒素密切相关，本文比较了这些菌株的产毒量，筛选出了４株高产毒菌株。     

生物素标记大肠杆菌热敏感和热稳定毒素基因探针对猪鸡分离株的…

用特异的大肠杆菌热敏感毒素（ＬＴ）和热稳定毒素（ＳＴ）标记的基因探针，以硝酸纤维素薄膜为载体，对从猪、鸡玢离的大肠杆菌进行杂交。结果表明，在从猪分离的４８株大肠杆菌中，分离自黄痢的３５株、分离自白痢的２株，分离自ＳＰＦ猪粪便的６株均产ＬＴ和ＳＴ；分离自长期拉稀的育成小僵猪粪便的５株中，只有４株产ＬＴ和ＳＴ，１株既不产ＬＴ也不产ＳＴ。从鸡分离的２８株大肠杆菌中，分离自雏鸡的１４株ＬＴ阳性率为８６％，     

致猪水肿病大肠杆菌毒力因子二重PCR检测方法的建立及应用

本试验分别针对志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)B亚基和F18ab茼毛fedA亚基保守序列设计2对引物,扩增长度分别为230 bp和510 bp,通过条件优化,建立了一种快速鉴定致猪水肿病大肠杆菌同时确定其致病因子的二重聚合酶链式反应(PCR)检测方法,对阳性扩增产物测序,结果都有很高的保守性.特异性试验和灵敏性试验表明:与其他6种猪常见致病菌(产毒多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门菌和链球菌)无交叉反应,菌体直接扩增法最低检出量为101cfu(D600为0.002).通过该二重PCR检测方法对2004-2006年自猪肺、脑组织中分离的216株大肠杆菌进行鉴定,得到6株致猪水肿病大肠杆菌,其中3株既具有菌毛又产水肿毒素,另外3株仅产水肿毒素;菌毛阳性菌株占毒素阳性菌株的50%.     

应用PCR检测产vero毒素大肠杆菌

根据产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌（ＶＴＥＣ）产生的ｖｅｒｏ毒素１（ＶＴ１）和ｖｅｒｏ毒素２（ＶＴ２）的基因序列，合成了２对寡核苷酸引物，建立了聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增方法。共对４株产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌和其他７个属的４１株肠道致病菌中的ＶＴ基因进行了检测，结果仅从用传统组织培养方法确定为ＶＴ阳性的产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌和痢疾１型志贺氏菌提取的ＤＮＡ中观察到了ＰＣＲ扩增产物，而从其他肠道致病菌提取的模板ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ片段。用这２对引物可以清楚地区分产ＶＴ１、ＶＴ２或ＶＴ１／ＶＴ２的大肠杆菌。ＰＣＲ扩增方法的检测敏感性为３２０ｐｇ全细菌ＤＮＡ，用ｖｔ１引物可以检测出低达３２ｐｇ的全细菌ＤＮＡ。     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

应用复合引物扩增大肠杆菌肠毒素基因的研究

以两对合成的不同寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、扩增肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）不耐热肠毒素（ＬＴ）和耐热肠毒素（ＳＴ）基因；两对引物从ＥＴＥＣＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ，２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交。ＬＴ扩增产物（３１４ｂｐ）和ＳＴ扩增产物（２３７ｂｐ）分别和ＳｍａⅠ和ＨｉｎｃⅡ酶切后，产生１９０ｂｐ和１２４ｂｐ，１４７ｂｐ和９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。同一扩增反应中应用ＬＴ和ＳＴ复合引物进行扩增，３种基因型ＬＴ、ＳＴ和ＬＴＳＴＥＴＥＣ从样品中鉴定出。１０９份动物腹泻粪样分别用ＰＣＲ，核酸杂交和ＥＬＩＳＡ进行测定，结果表明，ＰＣＲ是最为灵敏和快速的测定ＥＴＥＣ的方法。     

利用多联PCR技术检测致病性大肠杆菌肠毒素

根据GenBank上登陆的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)产生的STⅠ和LTⅠ、产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC)产生的SLT3种毒素基因序列,利用DNAstar软件针对其保守区设计并合成3对PCR引物:Pa1与Pa2、Pb1和Pb2、Pc1和Pc2,以上述引物分别对已知携带有3种毒素基因的质粒或菌株进行PCR扩增,将扩增产物连接入pGEMT-Vector,测序确认。随后进行了单项与二联PCR试验与优化,建立了较为特异和敏感的多联PCR反应体系,并对临床送检并分离鉴定的致病性大肠杆菌进行了肠毒素多联PCR检测。本研究建立的多联PCR技术可敏感、快速地检测大肠杆菌的肠毒素。     

大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析，确定了插入的ＬＴＢ基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列     

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌0157z4182基因设计1对引物，并在其5'端分别加入NcoI、XhoI酶切位点，用聚合酶链反应（PCR）从本试验用的大肠杆菌O157及1株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）08、1株肠道聚集粘附大肠杆菌（EAggEC)和1株产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）菌株中也扩增出了803BP的DNA片段。以大肠杆菌0157菌株94H的DNA为模板，用上述引物做PCR，将其产物连接到载体质粒pET28a( )，然后转化到宿主菌大肠杆菌LE392，从该菌中提取重组质粒，再将其转化到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），用PCR，限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定，表明Z4182基因定向克隆到了载体质粒Pet28a( )。将转化子培养并经IPTG诱导后，做SDS-PAGE电泳，表明该菌株可以表达Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌O157Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。     

用杂交基因探针检测埃希氏大肠杆菌分离株的肠毒素,志…

用单克隆杂交技术检测了纽约州６６６头牛及５７头猪分离的埃希氏大肠杆菌的肠毒素（ＳＴａＰ，ＳＴｂ，ＬＴ，ＳＬＴ－１及ＳＬＴ－Ⅱ）和粘着素（Ｋ８８，Ｋ９９，Ｆ４１，９８７Ｐ）。有３６７株牛源分离株（４５．２％）至少能与一个基因探针杂交，其中２２３株（３３．２％）与Ｆ４１、１１２株（１６．７％）与Ｋ９９、８２株（１２．２％）与９８７Ｐ，９６株（１４．３％）与ＳＴａＰ，７株（１．１％）与ＳＴｂ杂交。能与Ｋ     

类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体B亚单位基因的表达与鉴定

将由 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增并克隆在ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中的ｓｌｔⅡｅ Ｂ基因切出,并按预定的阅读框架插入表达性质粒载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ６ｐ１ 中的谷胱苷肽转移酶（ Ｇ Ｓ Ｔ）基因的下游。重组质粒 ｐｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１ 中以融合蛋白的形式表达 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（命名为 Ｇ Ｓ Ｔ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ）,即 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（７５６８ｋ Ｄ）与谷胱苷肽转移酶（２７３３５ｋ Ｄ）相连组成分子量为 ３４８８５ｋ Ｄ 的融合蛋白。通过对重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ的菌体裂解物的 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳分析,以及根据抗原抗体结合反应的免疫学特性,通过 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 鉴定,重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ（含有重组质粒 ｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ的大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１）可以大量表达融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ。根据 Ｇ Ｓ Ｔ 可与其底物谷胱苷肽结合的特性,用谷胱苷肽结合的 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ制备的亲和凝胶纯化表达产物,纯化的表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ,可以鉴定到分子量约为 ３５ｋ Ｄ 的蛋白条带,这与融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ分子量（３４８８５ｋ Ｄ）相当。     

应用多重PCR方法检测出血性大肠杆菌O157:H7

选择O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)分别设计引物,在同一扩增体系中进行PCR反应。在优化好的多重PCR反应条件下,对菌株及其它肠道菌进行检测。试验结果为：O157：H7菌株在250,207,179bp处均出现特异条带。试验结果表明,选择3对引物的多重PCR方法可特异、快速而且灵敏地对大肠杆菌O157：H7进行检测。