马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆…

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析

根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测     

伪狂犬病病毒(PrV)糖蛋白gE基因在重组杆状病毒中的表达

应用ＰＣＲ方法扩增出１．８Ｋｂ的伪狂犬病毒糖蛋白ｇＥ基因,克隆到ｐＵＣ１１９中形成重组质粒ｐＲＺＥ。经测序鉴定后再将ｇＥ基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９２中,形成重组质粒ｐＶＬｇＥ。将ｐＶＬｇＥ与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,获得重组病毒ｒｐＶＬｇＥ。通过ＰＣＲ方法鉴定证明ｇＥ基因正确插入到杆状病毒基因组中,直接免疫荧光试验和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ结果表明ｇＥ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９昆虫细胞中获得高效表达。表达的ｇＥ蛋白将作为伪狂犬病强毒的ｇＥ基因缺失弱毒疫苗鉴别诊断ＥＬＩＳＡ方法的抗原,为进一步扑灭伪狂犬病发挥重要作用。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导     

鸡新城疫病毒东北地区分离株融合蛋白基因的克隆与鉴定

以 Ｎ Ｄ Ｖ 东北地区分离株 Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 的基因组 Ｒ Ｎ Ａ 为模板, 通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增其 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并将其克隆到质粒ｐ Ｕ Ｃ１９ 中, 转化感受态大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α, 经分子量比较、酶切分析、 Ｐ Ｃ Ｒ 等鉴定方法证明, 我们分别获得了含有 Ｎ Ｄ Ｖ Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 株 Ｆ基因的阳性重组质粒。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性敢管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列，应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２，分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行了ＰＣＲ扩增，结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增产生４５７ｂｐ的特异性片段，而ＴＫＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ     

传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

本试验首先用ＰＣＲ方法扩增出ＩＬＴＶ ｇＢ基因,将其克隆到质粒ｐＵＣ１１９中,并进行了序列分析。将克隆的ｇＢ基因再亚克隆到禽痘病毒转移载体质粒中,然后,通过质脂体方法转染由禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）中,筛选蓝色的重组病毒,并对其进行了６轮蚀斑纯化。该重组病毒通过ＰＣＲ方法鉴定证明其基因组中含有完整的鸡传染性喉气管炎ｇＢ基因,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验证明了该重组鸡痘病毒表达了鸡传染性喉气管炎ｇＢ糖蛋白。     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF7基因的克隆及鉴定

本研究利用对应于ＡＴＣＣＶＲ－２３３２及ＬＶＯＲＦ７基因保守序列的１对均为２８个碱基的引物１００１１ＰＣＳ、１０１０ＰＣＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果扩增出了１条包括完整ＯＲＦ７基因的５１０ｂｐ的ＤＮＡ片段。纯化此扩增产物，并对其进行ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切，与用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ双酶切及碱性磷酸酶处理的ＰＵＣ１８载体连接。转化大肠杆菌。结果得到了１个Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒ＰＵＣ１８Ｂ１３ＯＲＦ７１０。通过ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ及ＰＣＲ证明此重组质粒即为Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒。从而为ＯＲＦ７基因及所表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础。     

伪狂犬病弱毒疫苗与野毒株PCR鉴别诊断方法的建立

目前，在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒（Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１）为了有效地地区弱毒免疫猪和野毒感染猪，本实验分别建立了一种通用和一种鉴别ＰＣＲ诊断方法，根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）ｇＢ，ｇＥ基因的序列，设计并合成了两对引物：ＰＢ１／ＰＢ２和ＰＥ１／ＰＥ２，以疫苗株Ｂａｒｔｈａｋ－６１及野毒株Ｓ，Ｓｕ，Ｆ，Ｌ，Ｙ及闽Ａ（Ｍｉｎ－Ａ）ＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，结果显示用引物Ｐ     

多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化

 在前期克隆获得Lp5CS基因的全长ｃＤＮＡ 序列基础上,采用ＰＣＲ 扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶基因p5CS的定点突变体系进行了探讨,并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证。根据突变位点序列设计一对引物,使用Ｐｆｕ高保真ＤＮＡ 聚合酶和超级感受态细胞ＤＭＴ,通过ＰＣＲ 扩增,获得含有所要突变位点的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ,定向克隆入真核表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００中,转化拟南芥验证基因功能。结果表明,预期位点上发生了突变,Lp5CS编码的第１２８位密码子已由苯丙氨酸残基（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ,简称Ｐｈｅ或Ｆ）变为丙氨酸残基（Ａｌａｎｉｎｅ,Ａｌａ）,证明用ＰＣＲ 技术已成功地使Lp5CS基因发生定点突变。转基因拟南芥Ｔ１ 代植株进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测,获得４个转基因阳性株系。拟南芥Ｔ２代植株经１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理７ｄ后,转基因株系脯氨酸含量分别为４２６２和５６２３μｇ／ｇＦＷ,显著高于野生型株系的２５８１μｇ／ｇＦＷ。说明转基因株系能积累更多地脯氨酸。     

猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9在猪肌肉和脑组织的表达分布

应用免疫组化分析猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达.用猪带绦虫卵1 mL(8万个/mL)灌胃20 d龄健康乳猪6头,于感染后40、80、120 d分别宰杀2头猪并取含囊尾蚴的肌肉及脑组织制作4μm厚石蜡切片,采用Envision二步法,观察不同时期寄生在肌肉及脑组织的猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9的表达.结果显...     

膜联蛋白B2基因的克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank已登录的猪囊尾蚴膜联蛋白B2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从猪囊尾蚴中扩增出膜联蛋白B2基因,将其克隆至pcDNA3.1表达载体上,经酶切鉴定和基因测序表明,目的基因AnnexinB2已正确地整合至表达质粒中,成功构建了膜联蛋白B2基因的真核表达载体.     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因，将扩增产物与pGEM—Teasy载体连接，重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting；用所表达的蛋白免疫小鼠，经ELISA检测血清抗体，验证其免疫原性。结果显示，所克隆的T24基因片段长716bp，含有1个678bp的开放阅读框，其编码226个氨基酸，与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％；表达的融合蛋白大小为40ku，并能被猪囊虫阳性血清识别；免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体，第30d达到较高水平，表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

苯骈咪唑类药物对猪囊尾蚴体外作用的光镜和扫描电镜观察

应用光学和扫描电镜观察了４种咪唑类药物对体外猪囊尾蚴的抑制作用,结果表明丙硫苯咪唑、磺苯咪唑、硫苯咪唑和氟苯咪唑对猪囊尾蚴均有抑制作用,前两者作用早于后两者。     

异源性抗原抗猪囊尾蚴感染的研究

本文报道了泡状带绦虫活化六钩蚴的超声裂解抗原可以诱导猪体产生抗猪带绦虫攻击感染的交叉保护作用。猪囊尾蚴匀浆抗原也使猪体产生了较强的抗猪带绦虫攻击感染的保护作用。泡状带绦虫六钩蚴超裂抗原免疫组与猪囊尾蚴匀浆抗原免疫组的保护情况是相似的,这表明异源免疫也可使猪体产生较好的抗猪囊尾蚴感染的免疫。由于制备异源性抗原的泡状带绦虫能够从狗的体内获得,因此在体外培养猪带绦虫未获成功之前可以解决从人体获取猪带绦虫的困难。     

早期诊断与治疗猪囊虫病试验

为探索早期诊断与治疗猪囊虫病的有效方法，采用ＥＬＩＳＡ诊断大通地区的猪血样１３８２头份，并对其中的７７头进行了剖检验证，还用丙硫咪唑治疗已确诊患囊虫病的猪５８头。试验结果：用ＥＬＩＳＡ检出猪囊虫阳性率为８．０３％；ＥＬＩＳＡ血检与剖检结果的阳性符合率为９２．３％，阴性符合率为９５．３％，总体符合率为９４．８％；丙硫咪唑对猪囊虫的杀灭率为９８．７％，治愈率为９３．７％，经治疗后让机体自身修复７—９个月时，达到鲜销标准的猪为７２．８％—９０．９％。     

抗猪囊虫循环抗原杂交瘤细胞系的建立和鉴定

建立了8株抗猪囊虫循环抗原(CA)的杂交病细胞系。其中6F12和2E7为抗囊虫特异McAb;McAb 1C6、1C7、1B5、4D9、2B9和8D8与囊虫、(?)球蚴、细颈囊尾蚴抗原均可发生反应。这些McAb的腹水ELISA效价为105～107,细胞培养上清液效价为102,并均可与病猪血清中的囊虫CA反应形成沉淀线。用1B5、6F12和8D8分别致敏血球,以反向间接血凝试验检测98份囊虫病猪血清,检出率分别为70.41%(69/98)、6.12%(6/98)和7.14%(7/98)。本研究制备的McAb可用于猪囊虫循环抗原检测。     

猪囊尾蚴抗原基因Ag1V1的克隆及其序列分析

根据NCBI上已知序列设计引物,利用RT-PCR技术从猪囊尾蚴中成功克隆了低分子量抗原基因Ag1V1,同源性和种系发育分析结果显示,河南分离株Ag1V1基因的核苷酸序列和预测氨基酸序列与日本分离株同源性为100％和98.9％,说明Ag1V1蛋白基因具有一定的保守性;通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原.     

Immunization procedure-related immunoglobulin levels in the development of antibodies against Cysticercus cellulosae

Various immunization procedures were investigated in an effort to improve the number of hybridomas producing antibodies against Cysticercus cellulosae. Ten groups of 5 BALB/c mice were subjected to different immunization procedures and were bled repeatedly over a period of 68 days. The samples of sera thus obtained were tested by enzyme linked immunosorbent assay: total immunoglobulins, IgG and IgM levels were determined. In general, total anticyst antibody titres increased during the course of immunization but in 3 groups the final titre was lower than the maximal antibody titre. Overall, immune tolerance did not appear to be a problem and longer immunization programs seemed to end with slightly higher antibody levels. So far, 4 mice from the group that exhibited the highest immunoglobulin levels have been used for hybridoma production. Out of 124 hybridomas thus obtained, only 1 secreted antibodies against Cysticercus cellulosae.     

猪囊尾蚴头节抗原的制备及间接ELISA方法的建立

采用Sephadex G-200层析技术纯化猪囊尾蚴头节抗原,用纯化抗原包被ELISA板,建立间接ELISA方法。通过各种条件优化,最终确定最佳试验条件为:抗原最适包被量为30mg/L;血清稀释度为1∶800;血清最佳反应时间为60min。结果表明,该方法具有较好的稳定性和重复性,可用于分泌抗猪囊尾蚴头节单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。