实时荧光定量RT-PCR检测剑尾鱼IgM mRNA方法的建立

根据剑尾鱼Xiphophorus helleri IgM和β-actin基因序列,分别在保守区域设计并合成引物,从注射免疫后的剑尾鱼头肾中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定。将所得标准品质粒以10倍梯度进行稀释,采用SYBR Green I染料进行荧光定量扩增,构建标准曲线并进行融解曲线分析。结果表明：构建的剑尾鱼IgM和β-actin基因的标准品Ct值检测范围分别为7~21和8~25,扩增效率分别为2.025、1.970;融解曲线分析结果显示具有特异的单个峰,其Tm值分别为82.43℃、86.09℃,表明扩增产物特异性非常好。本实验中建立的剑尾鱼IgM基因实时荧光定量PCR方法可用于对剑尾鱼IgM基因的转录水平进行测定。     

实时荧光定量RT-PCR检测剑尾鱼IgM mRNA方法的建立

根据剑尾鱼Xiphophorus helleri IgM和β-actin基因序列,分别在保守区域设计并合成引物,从注射免疫后的剑尾鱼头肾中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定。将所得标准品质粒以10倍梯度进行稀释,采用SYBR Green I染料进行荧光定量扩增,构建标准曲线并进行融解曲线分析。结果表明:构建的剑尾鱼IgM和β-actin基因的标准品Ct值检测范围分别为7²1和821和8²5,扩增效率分别为2.025、1.970;融解曲线分析结果显示具有特异的单个峰,其Tm值分别为82.43℃、86.09℃,表明扩增产物特异性非常好。本实验中建立的剑尾鱼IgM基因实时荧光定量PCR方法可用于对剑尾鱼IgM基因的转录水平进行测定。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

剑尾鱼CYP1A1基因mRNA定量PCR检测方法的建立

利用SYBR GreenⅡ荧光定量PCR技术,建立了剑尾鱼CYP1A1基因mRNA水平的定量分析方法.从苯并芘浸泡诱导后的剑尾鱼肝脏中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定.将所得标准品质粒10倍梯度稀释后构建标准曲线并进行熔解曲线分析.用苯并芘(20 μg/L)对剑尾鱼进行诱导,在第1、3、5、7、9、11天分别取肝脏,RT - PCR检测剑尾CYP1A1基因的相对表达量.建立了剑尾鱼CYP1A1基因表达的检测方法和定量标准曲线,构建的剑尾鱼CYP1A1和β-actin基因的标准品Ct值检测范围分别为10 ～26、12～26,扩增效率分别为100.53％、98.40％;建立的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数r2均在0.99以上;熔解曲线分析结果显示具有特异的单个峰,表明扩增产物特异性非常好,组内变异系数为0.15％～0.83％,组间变异系数为0.86％ ～ 1.66％.利用本方法对剑尾CYP1A1基因的相对表达量进行检测,结果表明苯并芘可显著诱导剑尾鱼CYP1A1基因的表达.诱导组剑尾鱼肝脏中CYP1A1相对表达量随着时间呈现先上升后下降的趋势,呈倒“U”形;对照组的CYP1A1相对表达量很低,随时间无明显变化.     

GCLV病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)的外壳蛋白基因的保守序列设计了一对引物,以全基因序列合成的方法获得质粒标准品,以此质粒标准品为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测GCLV的方法.该方法在4.2×101~4.2×107拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为106%,最低可检测42拷贝/PCR反应阳性标准品,比常规PCR敏感100倍;扩增产物的溶解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(77.5±0.9)℃;重复性好,组内变异系数为0.2%~1.1%.用该方法对疑似带病的大蒜材料进行检测,结果表明GCLV-SYBR GreenⅠPCR特异性强,操作简便,敏感性高,可以用于GCLV感染的检测及定量分析.     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

鸡马立克氏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

实时荧光定量PCR法检测草莓镶脉病毒

为了建立一种特异、灵敏、快速检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据已有的检测SVBV的引物信息,合成引物,对不同草莓品种进行PCR扩增。经过克隆、测序及序列比对得到了感染SVBV的阳性植株,利用此植株PCR扩增产物构建重组质粒作为标准品,优化了PCR反应体系,标准曲线的循环阈值（Ct值）与模板浓度有良好的线性关系（R2=0.999 1）;进行了灵敏度和重复性试验,敏感性可达到101拷贝·μL-1,约为普通PCR的1 000倍,重复性好;并与常规PCR方法进行了比较,成功建立了检测SVBV的实时荧光定量PCR法。用该方法检测了部分草莓品种的DNA样品,结果表明,大部分植株都带有SVBV。该方法具有很高的灵敏性和重复性,可用来快速检测草莓植株是否感染SVBV。     

鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于鸭源宿主细胞的蛋白激酶PKC基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank数据库的PKC基因设计、合成特异性引物,通过PCR技术扩增目的基因片段,构建重组质粒GV pXT19-TPKC,并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行重复性、特异性和敏感性验证。结果显示,荧光定量PCR标准曲线为y=-3.334 0x+44.199,相关系数为0.995 4,扩增效率为99.19%;熔解曲线仅出现单特异峰,未检测到H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒等参考毒株的核酸样本的荧光信号。说明,建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。     

食源性沙门氏菌PCR检测体系的建立及评估

为建立食源性沙门氏菌实时定量PCR检测体系,实现快速检测。根据GenBank数据库鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列(AE008832)设计引物,建立沙门氏菌实时定量PCR检测方法,通过标准曲线的建立和对40份牛奶和40份生肉进行检测评估检测体系的灵敏度和特异性。结果显示标准曲线相关系数为0.999,检出底限约8个细菌/反应。40份牛奶和40份生肉检测阳性率分别为2.5%和5%,与传统细菌分离检测结果完全相符。实时定量PCR检测沙门氏菌具快速、灵敏的优点,适宜于食品中沙门氏菌污染的调查及监测。     

獐茅AIHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因,根据已克隆的AIHAK1及β-actin碱基序列,分别设计了实时定量特异性引物,优化了反应的退火温度与引物浓度,并以优化的条件建立了相对定量标准曲线,同时对该方法的稳定性进行了评价.结果表明AIHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1.09和1.04,线性相关系数分别为0.996和0.997,批内及批间变异系数<5%.所建立的A1HAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好,为进一步探索AIHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AIHAK1农作物的检测奠定了方法学基础.     

草海鲫鱼染色体核型分析

为探讨草海鲫鱼核型组成特征,采用PHA和秋水仙素体内注射法直接制作肾细胞染色体标本,对35尾草海的鲫鱼染色体的核型进行了分析。结果表明:草海鲫鱼的肾细胞染色体组由150条基本染色体和若干小的超数染色体组成。染色体组型按着丝粒位置可分为4组:11对为中部着丝粒染色体(m)、8对为亚中部着丝粒染色体(sm)、11对为亚端部着丝粒染色体(st)以及20对端部着丝粒染色体,并且每个染色体组都可进行三三配对,即为三条同源染色体。草海中存在三倍体种群的鲫鱼,且该种群鲫鱼的染色体数目为3n=150+;其核型公式为3n=33m+24sm+33st+60t,其染色体臂数为NF=207。     

马铃薯黑痣病多重实时定量 PCR 检测方法的建立

为建立快速、准确、可靠的马铃薯黑痣病鉴定和检测方法,以黑痣病病原菌立枯丝核菌核糖体基因簇间的保守序列—转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）为靶区域,同时引入马铃薯细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase gene,Cox）作内参,应用多重实时定量 PCR 技术,建立马铃薯黑痣病病原菌TaqMan RFQ-PCR 多重快速检测方法。结果表明：RFQ-PCR 检测体系的引物-探针具有高度的特异性,灵敏度比普通 PCR 方法高10～100倍;内参基因的引入还可有效避免假阴性的出现。方法特异性强、灵敏度高、简单、快速、可靠。     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

实时荧光定量PCR检测弓形虫GRA6基因方法的建立和应用

[目的]在建立快速且准确检测牛弓形虫病的实时荧光定量PCR方法,以进一步研究该病对奶牛的感染情况,为临床诊断与防控提供依据.[方法]以已发表的牛弓形虫GRA6基因作为检测弓形虫病的目的基因,对上述基因各设计一对引物和一条Taqman探针,该探针5端用荧光基团JOE标记,3端用Eclipse标记,进行单重荧光定量PCR.[结果]经反应条件的优化,建立了能够检测牛弓形虫GRA6基因的荧光定量PCR方法.该方法具有具有较好的特异性和可重复性,对GRA6基因的检测最低限为7×100copies/反应,是普通单重PCR的灵敏度的100倍.[结论]用该方法对58份临床样品进行检测,有12份样品存在弓形虫感染,阳性检出率为20.69;,可用来对弓形虫进行快速、准确的检测.     

奶牛隐孢子虫SYBR Green Real-time PCR检测方法的建立

为建立一种方便快捷的检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,根据GenBank中已发表的隐孢子虫18s rRNA基因设计一对引物,并以从卵囊中提取的DNA为模版,初步建立了检测奶牛隐孢子虫的SYBR Green Real-time PCR方法,进而对采集的奶牛粪便进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,本研究建立的Real-time PCR方法敏感性高,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,扩增产物的特异性良好,重复性试验的标准差为0.494,重复性良好。研究表明,建立的Real-time PCR快速、特异、敏感,可用于奶牛隐孢子虫病的流行病学调查。     

武汉单极虫巢式聚合酶链反应检测方法的建立与优化

应用巢式聚合酶链反应(nested PCR)建立了一种检测异育银鲫武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)基因组DNA的方法,提取的DNA作为模板进行两次扩增,第一次扩增用单极虫18S rRNA序列通用引物:5'-CTGCGGACGGCTCAG TAAATCAGT-3'和5'-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3',扩增长度为1 584 bp;第二次依据第一次扩增产物中武汉单极虫特有的高度保守区设计特异性引物:5'-ACCCACTTCTGTGGC CTTTC-3'和5'-AATCCGACCTACAACGCTGG-3',扩增长度为853 bp。结果表明,通过PCR反应体系中退火温度、dNTP、Mg2+、延伸时间、扩增循环数和模板浓度的优化,优化后的巢式PCR最低DNA检测量达10 fg,优化后比常规PCR检测的灵敏度高104倍。因此,本文所建立的巢式PCR检测方法适合于水环境或水生动物中武汉单极虫的微量检测,也为异育银鲫武汉单极虫病的诊断和流行病调查提供了一种高灵敏的检测技术。