杨梅污染肺炎克雷伯氏菌的分离及其耐药特征和毒力基因

杨梅在生产与运输过程中易受到病原菌的污染,为分析杨梅中肺炎克雷伯氏菌的携带情况及肺炎克雷伯氏菌的耐药特征和毒力基因,分别从杭州市场和杨梅生产基地采集90份杨梅样品,测定大肠菌群污染状况,使用梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪和16S rRNA测序方法鉴定肺炎克雷伯氏菌,采用VITEK 2阴性菌药敏卡对所获得的肺炎克雷伯氏菌进行耐药表型分析,PCR扩增检测耐药基因和毒力基因。结果表明:90份样品中共有51份样品存在大肠菌群污染,污染率为56.7%,有9株肺炎克雷伯氏菌,检出率为10%,其中8株肺炎克雷伯氏菌聚为一簇。9株肺炎克雷伯氏菌对氨苄西林、头孢唑林和呋喃咀啶均呈不同程度的耐药,尤其是氨苄西林耐药率达88.89%。9株菌株均携带tetA基因,检出blaTEM、gyrA、aadA1和aac(6')-1b耐药基因的阳性率均为88.89%,blaCTX-M、floR、ereA、ermB和mecA等耐药基因未检出,毒力基因wcaG、magA、rmpA和菌素未检出。综上,杨梅中存在一定的肺炎克雷伯氏菌污染,但这些菌株未携带wcaG、magA、rmpA等毒力基因和菌素。     

白鲢肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

从患病白鲢鳃、肝胰脏分离到2株细菌,形态特征及生理生化反应完全一致.该菌为革兰氏阴性菌,具荚膜,粗短杆状,大小约（0.3～0.4）×（0.5～0.8）μm,单个存在或2个相连;发酵葡萄糖产酸产气,乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、尿素显阳性;对鸟氨酸、蛋白胨水、卫茅醇、苯丙氨酸、H2S均为阴性;V-P试验强阳性,细菌学鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌.分离菌经胸鳍基注射回归感染试验均出现与自然发病相似的症状.     

蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

亚洲岩蟒主要栖息在热带与亚热带森林,具有较高的药物、营养和经济价值,人工养殖中常因肺炎而死亡.为调查该病病因,对海南省养殖场发病蟒蛇进行心脏穿刺采集血样、细菌培养、革兰氏染色镜检、16S rRNA基因序列测定和BLAST分析等方法寻找病原,结果表明,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌.     

白鲢肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

从患病白鲢鳃、肝胰脏分离到2株细菌,形态特征及生理生化反应完全一致.该菌为革兰氏阴性菌,具荚膜,粗短杆状,大小约(0.3～0.4)×(0.5～0.8) μm,单个存在或2个相连;发酵葡萄糖产酸产气,乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、尿素显阳性;对鸟氨酸、蛋白胨水、卫茅醇、苯丙氨酸、H2S均为阴性;V-P试验强阳性,细菌学鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌.分离菌经胸鳍基注射回归感染试验均出现与自然发病相似的症状.     

水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

本研究从临床上水貂肺出血死亡的病例中分离到1株优势菌,通过细菌常规鉴定方法对该菌进行了形态特征、生化特性和16SrRNA测序等试验,并对该菌株进行了耐药分析和人工感染试验。结果显示,该菌是1株肺炎克雷伯氏菌,具有高度的耐药性,并且能致小鼠死亡。由此推断,该菌是致水貂死亡的主要致病菌。     

鸡肺炎克雷伯氏菌的生物学特性研究

鸡肺炎克雷伯氏菌可在２０－４５℃及ＰＨ５．５－１０范围内生长，最适生长温度为３７℃，最适ＰＨ值为７．０－７．６。在无盐条件下生长良好，最大能耐受８％ＮａＣｌ。该菌利用葡萄糖等产酸产气，利用枸橼酸盐和尿素，Ｍ，Ｒ阴性，Ｖ－Ｐ阳性，不产生Ｈ２Ｓ和吲哚不运动。对庆大霉素等药物敏感小白鼠对本菌易感，家兔有抵抗力。     

牛源肺炎克雷伯氏菌的生物学特性研究

为分析肺炎克雷伯氏菌致母牛乳腺炎及犊牛呼吸道疾病的发病原因，对分离的肺炎克雷伯氏菌进行荚膜型血清型分型、毒力基因与耐药基因检测以及药物敏感性试验。结果表明：2株肺炎克雷伯氏菌主要荚膜型血清型均为K2型，携带mrkD、fimH、wabG毒力基因；耐药基因检测显示携带TEM、SHV、DHA基因；该菌对大观霉素敏感，对氟苯尼考、磺胺间甲氧、磺胺二甲氧、头孢拉定具有耐药性。本研究可为致病性肺炎克雷伯氏菌防控提供参考。     

金丝猴肺炎克雷伯氏菌及埃希氏大肠杆菌败血症的病理学观察

肺炎克雷伯氏菌 (Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ)和埃希氏大肠杆菌 (Ｅ .ｃｏｌｉ)是动物肠道常见条件致病菌[1 ,2 ] ,当外界因素剧烈变化或机体抵力下降时 ,常可使动物致病 ,严重可致动物死亡。现观察了武汉动物园肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌合并感染致脓毒败血症而死亡的金丝猴病理学变化 ,为以后及时准确诊断和治疗本病提供依据。1　材料与方法病死金丝猴 ,雄性 ,1 5岁 ,由武汉动物园提供。死前 7ｄ发现右后肢行走不便 ,右前肢无力 ,不能抓拿食物和跳跃等症状 ,采食量正常。于死亡 2ｈ内对其进行病理剖检 ,无菌操作取肝、脑进…     

林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子的原核表达

为研究林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372的功能,采用PCR方法扩增林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372基因,连接T载体进行克隆,双酶切后连接表达载体pET-32(a),构建重组表达质粒,并转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,然后对其最佳表达时间、温度、IPTG浓度进行筛选,利用SDS-PAGE与Western Blot鉴定重组蛋白,得到约53.2 ku的融合蛋白,与预期大小一致。本研究成功构建kp05372基因表达载体,并筛选出最佳表达条件,为进一步研究该蛋白结构功能奠定了基础。     

部分环境因子对肺炎克雷伯氏菌和温和气单胞菌生长的影响

[目的]探索肺炎克雷伯氏菌、温和气单胞菌的最适生长环境。[方法]以分离自鱼类的肺炎克雷伯氏菌、温和气单胞菌为材料,研究高温、pH值、重金属对其生长特性的影响。[结果]肺炎克雷伯氏菌、温和气单胞菌的最适生长温度分别为37、28℃,且肺炎克雷伯氏菌对高温的抵抗力较强,温和气单胞菌对高温的抵抗力较弱。肺炎克雷伯氏菌、温和气单胞菌均在pH值为7的培养基中生长最旺盛。肺炎克雷伯氏菌、温和气单胞菌对Cr6+、Cu2+、Zn2+、Mn2+均产生较强的抗性,且温和气单胞菌对重金属离子的抗性较强,随着重金属离子浓度的增加,2种菌的生长量减少。[结论]该研究为进一步研究肺炎克雷伯氏菌和温和气单胞菌对动物的致病机制提供了依据。     

林麝肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其kp05372基因的生物信息学分析

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行测定;以小鼠感染试验和半数致死量(LD50)测试该病原菌的致病性;用全基因组测序方法对病原菌基因组进行测序分析,并对发现的新基因编码产物进行生物信息学分析。【结果】经生理生化试验和16SrRNA序列分析发现,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌,命名为GPKP,其对小鼠致死的LD50为6.3×107CFU/mL。该菌基因组大小为4 879 707bp,包含5 490个开放阅读框,共注释到22组COG功能。kp05372基因编码产物由302个氨基酸组成,无信号肽,是一种不稳定的、在细胞内发挥生理作用的亲水性蛋白。【结论】分离的细菌为肺炎克雷伯氏菌,kp05372基因编码产物属于典型的LysR家族转录因子(LTTR)。     

水貂源肺炎克雷伯杆菌分离、鉴定及疫苗潜能分析

水貂在夏季养殖时常出现出血性肺炎症状,病原大部分为铜绿假单胞菌。然而近10 a来采自河北、山东、辽宁等地水貂部分出血性肺炎病例中没有分离到铜绿假单胞菌,为探清病原,针对以上病料进行其他病原的分离鉴定。通过病料的细菌分离、常规鉴定,16S rRNA基因测序,动物回归试验、毒力试验、免疫原性试验及攻毒保护试验等,确定6株分离菌株有致病性,并被鉴定为肺炎克雷伯杆菌,分别命名为FY1、FY2、FY3、FY4、FY5、FY6,其中FY3为毒性最强的肺炎克雷伯氏菌(ZC1108株)。以该毒株对10月龄健康水貂进行肌肉注射,结果显示其致死率为100%(5/5);以该菌株制备的灭活疫苗免疫水貂后攻毒保护率达100%(5/5),试验水貂全部健活。表明肺炎克雷伯氏菌(ZC1108株)灭活疫苗免疫原性良好。     

肺炎克雷伯菌噬菌体分离鉴定及抑菌效果研究

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染,以及对生物被膜清除的能力,以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnM-YP11,并通过透射电镜观察噬菌体形态特征;通过双层平板法测定噬菌体宿主谱;通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性;通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系;通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果;通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnM-YP11,能形成清晰透亮噬菌斑,透射电镜观察vB_KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱,表明vB_KpnM-YP11能够裂解 18/34 株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB_KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB_KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min,爆发期为50~90 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为69 PFU/cell,在pH（3~11）和温度（4~60 ℃）范围内活性稳定。4）vB_KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%,注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA,不含耐药基因及毒力基因。5）vB_KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时,具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB_KpnM-YP11效价为10⁸ PFU/mL,10⁹ PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下,12 h内vB_KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上,本研究分离获得噬菌体vB_KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高,不仅能抑制和清除生物被膜,同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果,具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。     

诃子提取物对3种致病菌的体外抑菌效果及其机制研究

为探究诃子在畜禽疫病防控中的作用及应用潜力，以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌3种常见致病菌为对象，对比诃子和其他11种中药提取物的抑菌圈直径和最小抑菌浓度（MIC），分析诃子培养上清液的总漏出率和电导率、蛋白浓度及诃子对细菌DNA和蛋白含量的影响。结果显示：诃子比其他11种中药的抑菌效果更强，表现为抑菌圈直径更大，MIC更低。培养上清液的电导率和漏出率增加，用2倍MIC诃子药液处理8 h后，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌上清液蛋白浓度显著增加（P<0.05）。诃子抑制大肠埃希菌蛋白合成，使分子质量约为80 ku的蛋白缺失；对肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌蛋白质合成影响不明显，对细菌DNA也没有明显的凝胶阻滞作用，但能降解DNA。以上结果表明：诃子具有较好的抑菌效果，其作用机制是通过破坏细菌细胞膜通透性，抑制细菌核酸和蛋白合成而发挥抑菌作用。     

蜡蚧轮枝菌生物学特性及其与榕母管蓟马毒力的相关性

【目的】探讨蜡蚧轮枝菌生物学特性与菌株对榕母管蓟马毒力的相关性,为榕母管蓟马优质高效生防菌株的初步筛选提供参考。【方法】室内观察蜡蚧轮枝菌V07、V16063、V3450和Vp28 4株菌株的生物学特性,测定其对榕母管蓟马成虫的毒力,通过逐步回归分析探讨两者间的相关性。【结果】4株蜡蚧轮枝菌菌株的生物学特性存在异同,产孢量和孢子萌发率均很高,但V3450菌株生长速度最快,孢子GT50最短;V16063和Vp28菌株生长速度较快,孢子GT50较短;V07菌株生长速度最慢,孢子GT50最长。榕母管蓟马成虫受供试菌株侵染后的死亡趋势均随菌剂浓度升高和侵染时间延长而上升,但不同菌剂中的变幅则明显不同,侵染致死效果依次为V3450V16063Vp28V07,LT50依次为V3450V16063Vp28V07。逐步回归分析表明,菌株生长速度和孢子GT50对累计校正死亡率和LT50的作用均达显著水平。【结论】在供试菌株产孢量和孢子萌发率均很高时,菌株生长速度和孢子GT50可作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的初筛指标。     

鳙鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及其毒力基因检测

从患病鳙鱼中分离纯化得到一株优势菌株AH-YS,通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定以及16S r RNA基因扩增、测序和系统进化分析等操作,结果显示,分离到的细菌为维氏气单胞菌。药敏试验显示,在使用的11种抗菌药物中,该菌株对氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星等9种药物敏感,对甲氧苄氨嘧啶和氨苄西林耐药。对9种毒力基因的扩增结果显示,可以检测到气溶素、细胞毒性肠毒素、鞭毛、弹性蛋白酶和酯酶5种。     

碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响

为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,添加0.024、0.048、0.072、0.096和0.120 mol/L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(Aer A)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。结果表明,5个实验组嗜水气单胞菌的AHH-1、AerA和ahyB表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明,添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势,表明毒力逐渐减小。     

新疆地区牛分枝杆菌29个毒力基因的突变分析

为了解我国新疆地区牛分枝杆菌的毒力基因变异情况并初步评估其毒力变化,利用聚合酶链式反应(PCR)检测临床分离的66株牛分枝杆菌的29个毒力基因,经Sanger测序后与标准株AF2122/97和本实验室保存的两株牛分枝杆菌(M.bovis C68004和M.bovis N)进行序列比对,对基因突变情况进行统计,分析基因突变对其编码蛋白功能和结构的影响。结果表明:1)临床分离株与本实验室保存的高毒力菌株M.bovis N毒力基因突变位点具有很高的相似性,在检测的29个毒力基因中,50%以上临床分离株与M.bovis N共有25个基因序列一致;2)临床分离株广泛存在的Mb2958、Mb2982C和Mb1553C基因突变PROVEAN评分均低于-2.5,可能改变其编码的酶催化活性,进而影响细胞壁脂类合成;3)Mb0607、Mb0609、Mb0606、Mb2979C和Mb1214基因突变分别造成哺乳动物细胞入侵蛋白、甲基转移酶和酰基转移酶蛋白二级结构改变,或许对细菌的胞内生存产生影响。综上,本研究筛选出8个关键毒力基因,这些基因的突变可能在新疆地区牛分枝杆菌流行菌株的毒力变化中发挥重要作用;同时,本研究揭示了关键毒力基因的突变特征,为进一步研究牛分枝杆菌遗传多样性及进化规律奠定了基础。     

五指山猪肺炎克雷伯菌肺炎亚种的分离及鉴定

从发病猪场濒死的五指山小猪肝脏、脾脏、小肠中分离到3株革兰氏阴性杆菌,对分离菌株进行形态学、培养特性、生化特性和分子生物学鉴定,确定分离菌株为肺炎克雷伯菌肺炎亚种。利用细菌16S rRNA通用引物对3株细菌基因组DNA进行扩增,均可得到大小为1 503 bp的特异性片段,该序列与GenBank上已经登录的猪源肺炎克雷伯菌序列同源性达99%。动物毒性试验证明其对小鼠有较强的致病性。     

西藏那曲牦牛源多杀巴氏杆菌荚膜分型及其毒力基因检测

为确定2018年7—11月西藏那曲牦牛发病的死亡原因,以安多县、班戈县、聂荣县和色尼区的26头病死牦牛内脏组织为研究对象,利用常规细菌培养法和特异性基因PCR方法,对分离菌进行鉴定,并对其荚膜血清类型、毒力基因以及致病性进行研究。结果表明:纯化得到13株分离菌,分离菌的菌落特征、菌体形态、生化鉴定结果均与多杀巴氏杆菌相符,并扩增出多杀巴氏杆菌特异性基因Kmt-1和16S rDNA,菌株Pm-1和Pm-2的Kmt-1基因序列与印度、伊朗、巴基斯坦、俄罗斯的牛源多杀巴氏杆菌的同源性均达98%以上;13株菌的荚膜分型鉴定结果均为B型;对分离菌进行已知的23种毒力基因检测结果显示,此次分离到的13株菌毒力基因的数量在16～19种,ptfA、fimA等16种毒力基因检出率为100%,tadD、toxA等4种毒力基因检出率为0,且每个地区分离株毒力基因的分布相同;致病性试验中对照组小鼠全部存活,处理组小鼠死亡时间为24～72 h,死亡率为100%,病变主要表现为脾脏、肺脏、肝脏、心脏出血坏死。导致此次那曲地区牦牛发病死亡的原因为荚膜B型多杀巴氏杆菌病,本研究可为该病的防治提供依据,也为下一步预防疫苗的研究提供了优势菌株。