一株猪源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

为确定黑龙江省某养殖场因呼吸道症状急性死亡病猪的致病菌,并探究其主要生物学特性,本研究采集病死猪内脏组织,通过细菌分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S r RNA基因的PCR扩增、测序、系统进化树的构建对分离菌进行种属鉴定;通过微量肉汤稀释法分析该菌对8类10种抗生素的敏感性;通过Illumina PE150对细菌全基因组测序,采用ResFinder软件分析分离菌的耐药基因,并分析耐药基因与耐药表型的相关性。利用VFanalyzer软件、BLASTN比对分离菌的毒力基因。结果显示,该菌株在10%脱纤维羊血平板培养基上培养24 h后形成表面光滑具有β-溶血环的单菌落;革兰氏染色结果显示呈蓝紫色短棒状杆菌;生化鉴定结果显示该分离菌的生化特性与化脓隐秘杆菌符合。16S r RNA基因的PCR结果显示,扩增到1 397 bp的目的基因序列,与GenBank中序列比对结果显示该菌株与已报道的化脓隐秘杆菌同源性高达99%。16S r RNA基因系统进化树分析结果显示分离菌与辽宁沈阳的牛源化脓隐秘杆株TZQ 01株处于同一分支,与日本的猪源分离株NIAH13531处于较近分支,以上结果可确定该分离菌为...     

新疆奶牛副结核分枝杆菌的分离鉴定

为进一步确定新疆某规模化牛场疑似奶牛副结核病病原,本研究从PCR检测阳性牛粪便样本中共分离获得4株细菌,对其进行菌落形态观察、抗酸染色镜检以及16S r RNA、IS900特异性基因及亚型分型基因的扩增、序列测定与分析。结果显示,所分离的4株细菌为抗酸染色阳性菌,对其IS900基因及亚型分型基因检测均为阳性,它们的16S r RNA、IS900基因及亚型分型基因之间同源性为100%,与Gen Bank中登录的副结核分支杆菌序列同源性在99%以上,从而确定所分离的4株菌株均为Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌。     

利用RFLP分型方法鉴定牛源性链球菌和肠球菌

为分离及种属鉴定引起牛乳腺炎相关的链球菌和肠球菌,本研究于兰州及周边地区采集疑似奶牛乳腺炎乳样382份,通过THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基初步分离到67株疑似链球菌或疑似肠球菌。参照已发表文献合成链球菌属16S r RNA和16S~23S r RNA间隔区基因引物序列,扩增分离菌株16S~23S r RNA间隔区序列,产物分别利用AluⅠ和RsaⅠ单酶切消化,并以参考菌株的16S~23S r RNA酶切图谱为参考,对分离株进行限制性片段多态性(RFLP)分类分析;再选取各RFLP类群的任一菌株,扩增其16S r RNA基因并测序,并经NCBI核酸数据库进行比对,结果显示67株疑似链球菌中有53株为粪肠球菌(79.1%)、3株为屎肠球菌(4.5%)、3株为肠道肠球菌(4.5%)、8株为无乳链球菌(11.9%)。结果表明肠球菌属细菌(粪肠球菌、肠道肠球菌、屎肠球菌)与兰州市及周边地区奶牛乳腺炎的发病紧密相关,肠球菌属细菌与链球菌属细菌16S r RNA基因同源性很高,但可以通过分子生物学方法准确区分。     

15株禽源空肠弯曲菌的分离鉴定及CheW基因序列分析

为了解四川地区禽源空肠弯曲菌流行菌株的感染情况及其Che W基因的变异特点,本研究于四川地区采集禽源盲肠及内容物对空肠弯曲菌进行分离并纯化培养,将分离菌株进行染色镜检、生化试验、16S r RNA基因PCR鉴定,并对分离株的Che W基因进行克隆测序,选取Gen Bank中登录的10株国内外空肠弯曲菌菌株与分离株进行Che W基因的序列分析及遗传进化分析。结果显示:分离株经纯化培养于哥伦比亚血琼脂培养基上后出现无溶血现象的菌落;革兰染色为阴性;生化代谢类型较稳定且与相关报道一致;16S r RNA基因序列与空肠弯曲菌(NCTC11168、YQ2210)等菌株同源性为99%以上。15株分离菌株的Che W基因的核苷酸序列与所选参考株一致性为98.68%,其推导的氨基酸序列同源性一致性在98.9%以上。其中鹌鹑源分离株CJ-1、CJ-2、CJ-4、CJ-13、CJ-14在第22位和161位均出现单个碱基的置换为A→G。本实验中分离菌株均为空肠弯曲菌且分离菌株之间Che W基因保守性强,遗传变异动态性较弱。本研究为空肠弯曲菌遗传变异方面的相关动态研究提供参考依据。     

1株鸭源棒状杆菌的分离及鉴定

从四川某鸭场发病种鸭的肝脏组织中分离到1株革兰阳性杆菌,通过形态特征、培养特性、生化特性进行鉴定,并进行药敏试验,应用通用引物对其16S r RNA基因进行克隆与序列分析。结果显示,分离细菌在血琼脂平板生长良好,能发酵部分糖类。系统进化分析显示,分离菌株与棒状杆菌属细菌遗传进化关系较密切,其16S r RNA基因序列与棒状杆菌代表菌株的同源性在87.1%~98.9%之间,分离菌鉴定为棒状杆菌。     

鱼源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为探究鱼源蜡样芽孢杆菌的致病性和耐药性及指导科学用药,本试验采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rDNA基因扩增及系统进化树构建等方法鉴定分离菌,人工感染试验确定分离菌的致病性,耐药基因检测和药敏试验确定菌株耐药性。结果显示,分离菌株形成边缘不规则、不光滑的乳白色菌落,为需氧型革兰氏阳性菌。葡萄糖、硝酸盐、明胶液化等生化反应为阳性,木糖、阿拉伯糖、甘露醇等生化反应为阴性。16S rDNA基因片段长度为1 457 bp,在系统发育树中,分离菌与蜡样芽孢杆菌RTR菌株亲缘关系最近,与蜡样芽孢杆菌的同源性均达到99%以上,从而综合判定分离菌株为蜡样芽孢杆菌。人工感染试验发现,分离菌株对黄颡鱼有一定的致病性。耐药基因检测结果显示,分离菌株中检测出Sul1和Sul2两种耐药基因。药敏试验发现,该菌株对庆大霉素、哌拉西林、米诺环素等敏感,对头孢哌酮中度敏感,对青霉素、头孢曲松、氨苄西林等耐药。本试验结果为有效防控蜡样芽孢杆菌感染的疾病提供了科学参考资料。     

鱼源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为探究鱼源蜡样芽孢杆菌的致病性和耐药性及指导科学用药,本试验采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rDNA基因扩增及系统进化树构建等方法鉴定分离菌,人工感染试验确定分离菌的致病性,耐药基因检测和药敏试验确定菌株耐药性。结果显示,分离菌株形成边缘不规则、不光滑的乳白色菌落,为需氧型革兰氏阳性菌。葡萄糖、硝酸盐、明胶液化等生化反应为阳性,木糖、阿拉伯糖、甘露醇等生化反应为阴性。16S rDNA基因片段长度为1 457 bp,在系统发育树中,分离菌与蜡样芽孢杆菌RTR菌株亲缘关系最近,与蜡样芽孢杆菌的同源性均达到99%以上,从而综合判定分离菌株为蜡样芽孢杆菌。人工感染试验发现,分离菌株对黄颡鱼有一定的致病性。耐药基因检测结果显示,分离菌株中检测出Sul1和Sul2两种耐药基因。药敏试验发现,该菌株对庆大霉素、哌拉西林、米诺环素等敏感,对头孢哌酮中度敏感,对青霉素、头孢曲松、氨苄西林等耐药。本试验结果为有效防控蜡样芽孢杆菌感染的疾病提供了科学参考资料。     

一株猪源乳杆菌的分离鉴定

从猪小肠中分离得到一株乳杆菌,对其进行生理生化鉴定、16S r DNA基因测序和同源性分析。分析结果显示,该菌株的菌落有溶钙圈,白色圆形,边缘光滑,无鞭毛,无荚膜,无芽孢的革兰氏阳性杆菌,16SrDNA序列与NCBI公布的约氏乳杆菌Lactobacillus gasseri的同源性为98.7%,将该菌株鉴定为格氏乳杆菌。     

渔用芽孢杆菌制剂中菌株的分离与鉴定

为了解不同剂型渔用芽孢杆菌制剂中优势菌株情况,本研究对市售4种不同类型、使用效果良好的芽孢杆菌制剂进行培养分离、革兰氏染色和16S r RNA测序鉴定。结果显示:酶制剂中地衣芽孢杆菌为优势菌群,饲料添加剂中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主要菌群,复合菌中地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌为主要菌群,粬种中的主要菌群为地衣芽孢杆菌。据结果推测,地衣芽孢杆菌为目前水产养殖业较为普遍使用的芽孢杆菌。     

健康反刍动物源饲用芽孢杆菌的分离筛选和鉴定

为筛选到性能良好的芽孢杆菌,笔者在呼和浩特郊区的几个健康牛羊养殖场采集了粪样、水样等28份样品进行芽孢杆菌资源调查。经分离和纯化培养,共分离出疑似芽孢杆菌35株,并通过16S r RNA及17项生化鉴定对其作进一步的确认和属种鉴定。经16S r RNA分析,有15株为芽孢杆菌属;再经染色镜检,生化试验结果与《常见细菌系统鉴定手册》对比,有枯草芽孢杆菌4株(占26.7%)、蜡状芽孢杆菌5株(占33.3%)、泛酸芽孢杆菌3株(占20.0%)、环状芽孢杆菌2株(占13.3%)、球形芽孢杆菌1株(占6.7%)。说明呼和浩特市郊区健康牛羊养殖场芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌为主,占60%。     

副猪嗜血杆菌黑龙江株的分离与鉴定

为确定黑龙江某猪场发病猪群的病原,本研究从疑似浆膜炎的病料中分离到一株革兰氏阴性细小杆菌,通过对其进行细菌形态学、培养特征、生化特性和16S rRNA基因PCR鉴定,结果表明该分离菌株为副猪嗜血杆菌(HLJ-1分离株)。16S rRNA基因序列分析结果显示:该分离菌株与参考株的基因同源性达99%;药敏试验结果表明HLJ-1分离株对头孢曲松、头孢噻肟等β-内酰胺类抗生素高度敏感;小白鼠致病性试验结果显示,该分离株具有较强致病性。     

副猪嗜血杆菌广东流行株的分离鉴定与基因分析

本研究从广东省各个地区送检病料中成功分离鉴定了4株副猪嗜血杆菌,并且针对副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性进行PCR检测和基因测序同源性分析,通过GenBank联机比对分析,所分离的菌株与国内外菌株16S rRNA序列同源性在98.2%以上,分离菌株之间同源性在99.6%~100%之间,证明了所暴发的菌株是副猪嗜血杆菌。     

牛场地表土壤中芽孢杆菌的分离与鉴定

以呼和浩特市某牛场地表土壤为研究对象,通过传统的微生物培养方法和基于16S r RNA基因序列的新型分子生物学方法对其中的微生物进行了分析。结果显示在牛场地表土壤中共鉴定出蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)、产芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)、纯黄肠球菌(Enterococcus gilvus)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)共40株,并通过16S r RNA基因序列的系统发育树研究得到蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌这三种优势芽孢杆菌之间的亲缘关系。该研究为后续开发应用于无抗饲料添加剂和生物农药的绿色、安全、高效的益生芽孢杆菌微生态制剂提供一定的数据基础。     

猪源肺炎克雷伯菌的分离鉴定

为确定四川某猪场导致猪细菌性感染死亡的病原,本研究从送检病死猪肺脏样品中分离得到一株细菌,对该菌株进行培养特性观察、生化试验、动物致病性试验、药敏试验、16S r RNA基因的扩增及测序鉴定。结果显示其16S r RNA基因序列与肺炎克雷伯菌(Kpn)序列同源性达99%,表明该菌株为Kpn肺炎亚种;致病性试验结果显示其对小鼠具有强致病性;并且在血平板上出现α溶血现象;药敏试验结果显示分离菌株表现出多重耐药性,毒力较强,并且在培养特性上发生一定的改变。本实验为进一步研究Kpn耐药机制和致病机理奠定了基础。     

一株兔源地衣芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

利用厌氧菌分离技术从兔肠道中分离出1株芽孢杆菌,通过培养特征、形态观察及生化鉴定,结合16S r RNA基因序列测定与同源性分析,采用平板稀释法对分离株进行了耐酸、耐胆盐、耐高温及安全性检测等生物学特性研究。结果表明,分离株为一株地衣芽孢杆菌,并命名为Bacillus licheniformis WZ01,该菌株具有安全性及良好的耐高温、耐胆碱、耐酸良好的益生菌特性。     

几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

为比较几种商用益生芽孢的菌株特性,为芽孢杆菌的选育提供理论基础,本试验收集整理了15种药用(Y1~Y6)和饲用益生芽孢杆菌(S7~S15)产品,对其芽孢杆菌进行分离鉴定,分别从产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶等酶活特性,抗菌活性,耐酸和耐0.3%胆盐稳定性,抗生素敏感性,耗氧及生长速率测试等方面对芽孢杆菌特性进行了比较研究。结果显示,分离的15株芽孢杆菌均能产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶,但不同菌株产酶能力差异较大,S9菌株表现出较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活力;所有分离的芽孢杆菌均能对金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌产生显著抑制活性,但只有7株芽孢杆菌(Y2、Y6、S7、S9、S10、S11、S12)可对大肠杆菌产生抑制作用,尤其是S9菌株综合抗菌能力最强。S9、Y2和S8的营养体细胞具有较高的耐酸能力,S9、Y2菌株在0.3%胆盐环境中存活率超过90%。15株芽孢杆菌中有3株饲用来源菌株(S10、S12、S13)表现出对红霉素的耐受,S10菌株对四环素耐受。此外,S9菌株具有较快的耗氧速率和生长速率。上述结果表明,S9菌株(解淀粉芽孢杆菌)的益生特性更为优良,本试验结果可为芽孢杆菌益生菌的选育及活性评价提供参考依据。     

西藏牦牛腹泻性大肠杆菌的分离鉴定

为探讨西藏那曲市申扎县牦牛腹泻的原因，本试验无菌采集11份腹泻牦牛粪便样品进行细菌分离培养、染色镜检，对检测菌株的16Sr RNA基因进行扩增、测序，序列上传至Gen Bank进行比对，并使用DNAStar进行同源性分析，构建遗传进化树。分离结果表明，11份样品中共分离出5株菌株，在MAC培养基上菌落呈粉红色，革兰氏染色镜检后发现所有菌株均为阴性且两端钝圆的直杆菌；16Sr RNA基因同源性分析结果显示，5株分离株16Sr RNA序列同源性在90%以上，与大肠杆菌参考序列的同源性达到95.2%以上；遗传进化树显示，XZ-1、XZ-5分离株与大肠杆菌AT125株、PAK/SA4株亲缘关系较近，XZ-2、XZ-3和XZ-4分离株与大肠杆菌RM13322株亲缘关系较近，经以上鉴定可知分离菌为大肠杆菌。     

几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

为比较几种商用益生芽孢的菌株特性，为芽孢杆菌的选育提供理论基础，本试验收集整理了15种药用（Y1~Y6）和饲用益生芽孢杆菌（S7~S15）产品，对其芽孢杆菌进行分离鉴定，分别从产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶等酶活特性，抗菌活性，耐酸和耐0.3%胆盐稳定性，抗生素敏感性，耗氧及生长速率测试等方面对芽孢杆菌特性进行了比较研究。结果显示，分离的15株芽孢杆菌均能产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，但不同菌株产酶能力差异较大，S9菌株表现出较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活力；所有分离的芽孢杆菌均能对金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌产生显著抑制活性，但只有7株芽孢杆菌（Y2、Y6、S7、S9、S10、S11、S12）可对大肠杆菌产生抑制作用，尤其是S9菌株综合抗菌能力最强。S9、Y2和S8的营养体细胞具有较高的耐酸能力，S9、Y2菌株在0.3%胆盐环境中存活率超过90%。15株芽孢杆菌中有3株饲用来源菌株（S10、S12、S13）表现出对红霉素的耐受，S10菌株对四环素耐受。此外，S9菌株具有较快的耗氧速率和生长速率。上述结果表明，S9菌株（解淀粉芽孢杆菌）的益生特性更为优良，本试验结果可为芽孢杆菌益生菌的选育及活性评价提供参考依据。     

牦牛源蜡样芽胞杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了研究牦牛源蜡样芽胞杆菌致病性和耐药性,本实验对其进行了细菌形态学观察、16S rDNA PCR和序列比对、动物回归试验及药敏分析。结果显示：56份牦牛奶样,分离出135株细菌,对分离菌进行16S rDNA PCR并测序,其中有42株为蜡样芽孢杆菌,蜡样芽胞杆菌检出率为75%(42/56),占总检出细菌的31.11%(42/135);其中分离菌株B2019 16S rDNA PCR测序结果与Gen Bank中蜡样芽胞杆菌的同源性为88.6%～99.3%,运用Mega7.0将分离菌株B2019与6株参考菌株的16S rDNA序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树;在动物回归试验中小鼠腹泻,剖检小鼠发现肝脏肿大,肺脏边缘有出血;药敏试验结果显示,分离菌株对麦迪霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、万古霉素、氧氟沙星、环丙沙星、呋喃唑酮和米诺环素等13种抗生素表现出高度敏感,对多粘菌素B表现为中介,对其他16种抗生素均表现为耐药。试验结果表明该分离菌株是一株具有较强致病性的蜡样芽胞杆菌。     

一株黑叶猴源鸟肠球菌的分离鉴定及耐药分析

黑叶猴是我国一级重点保护动物,2018年11月贵州某动物园中黑叶猴出现死亡,为调查其原因,本研究采集病死黑叶猴的肺脏样品进行细菌分离纯化,并对分离菌进行革兰氏染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因序列鉴定、小鼠致病性试验及分离株的药敏试验和耐药基因检测。结果显示:经形态观察、培养特性鉴定以及16S r RNA的PCR鉴定,该分离株为鸟肠球菌,将其命名为GZ1811;16S rRNA基因的同源性分析及进化树结果显示,GZ1811株与GenBank中鸟肠球菌的一致性为100%;小鼠致病性试验结果显示,小鼠出现临床症状,甚至死亡,解剖可见其肺脏有散在出血点;药敏试验结果显示,分离株对四环素等药物耐药。耐药基因PCR检测结果显示分离菌株的四环素类耐药基因tetM呈阳性,表明耐药表型和耐药基因型一致。本实验为黑叶猴鸟肠球菌病的诊断和防治提供具有科学价值的参考依据。