牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2三基因的串联表达及其免疫原性研究

为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。     

SIP亚单位疫苗对无乳链球菌诱导小鼠乳腺炎的保护力评价

无乳链球菌是导致奶牛乳腺炎的重要病原菌,本研究评价了SIP(surface immunogenic protein)亚单位疫苗对小鼠无乳链球菌乳腺炎的免疫保护效果。制备无乳链球菌SIP亚单位疫苗和灭活疫苗,对小鼠进行免疫,并设PBS阴性对照。免疫前后采血测定IgG及IgG亚类的抗体滴度。免疫小鼠分娩后第4天,进行无乳链球菌乳腺攻毒试验。24h后扑杀攻毒鼠,进行乳腺内CFU的测定,制作并观察乳腺组织病理切片。结果显示,SIP亚单位疫苗免疫组IgG及IgG亚类抗体滴度显著高于灭活疫苗组(P0.01)。免疫哺乳小鼠乳腺攻毒后,SIP亚单位疫苗免疫组小鼠乳腺CFU显著低于灭活疫苗组及对照组(P0.001)。乳腺病理切片显示SIP亚单位疫苗组乳腺组织结构较对照组完整,且中性粒细胞浸润程度最小。本研究表明,无乳链球菌SIP亚单位疫苗有望作为奶牛无乳链球菌乳腺炎的候选亚单位疫苗。     

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。     

评价牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力BALB/c鼠模型的建立

为建立评价流产布鲁氏菌疫苗株免疫保护力的小鼠模型,选取6周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,随机分为3组(n=40):A19免疫攻毒组、非免疫攻毒组和PBS对照组。A19免疫组腹腔接种BALB/c鼠A19 5.0×10⁴ CFU,非免疫攻毒组和PBS对照组均接种PBS液0.2 mL。免疫后45 d,A19免疫攻毒组和非免疫攻毒组BALB/c鼠以3.0×10⁴ CFU剂量的2308强毒株攻击,攻毒后15和45 d分别剖杀小鼠,取小鼠脾脏称重、细菌分离、病理组织学检测。结果表明,攻毒后15 d,A19免疫攻毒组与未免疫攻毒组和PBS对照组之间克脾指数差异显著(P<0.05);攻毒后45 d,A19免疫攻毒组与PBS对照组的克脾指数差异不显著(P>0.05),与未免疫攻毒组克脾指数差异显著(P<0.05);免疫攻毒组的小鼠组织病理变化明显轻于未免疫攻毒组。结果表明,用BALB/c鼠为试验动物,以A19为疫苗参考株建立动物实验模型可以应用于牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力评价。     

应用BALB／c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB／c小鼠，同时设空白对照组，每组8只。免疫后每7d采血一次，用液相阻断ELISA（LPB-ELISA）检测血清抗体水平；第28d用800LD50同源强毒攻击，攻毒后36h，每组随机选取3只BALB／c小鼠，采全血，分别用每只BALg／c小鼠全血注射12只乳鼠，每组共注射36只乳鼠，以乳鼠试验判定BALB／c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明，免疫组BALB／c小鼠均可产生特异性抗体，保护率分别为75．0％、63．9％、36．1％；对照组小鼠血清抗体为阴性。提示，BALB／c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定

为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk及纤连蛋白FbsA三重活性的多亚单位融合蛋白,研究其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性,根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因的核苷酸序列,利用DNAStar软件对蛋白的抗原表位序列进行分析并设计合成包括重叠PCR引物共4对引物,通过重叠PCR技术将前2个基因主要抗原区域进行拼接后插入pET30a(+)载体,再将第3个基因插入。为减少三重基因串联表达过程中3个蛋白之间空间构象的干扰,在3个基因连接处各引入1段45bp的柔性linker,结果重组基因在BL21感受态中实现了可溶性表达,表达的蛋白约62 000;Western blot试验表明多亚单位融合蛋白可被无乳链球菌多抗识别,且由此融合蛋白制备小鼠多抗能够识别sip、pgk及FbsA等3个蛋白;这表明构建的多亚单位融合蛋白可能具备sip、pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保护性试验中,重组多亚单位融合抗原对攻毒小鼠的保护优于单个蛋白。本试验为牛无乳链球菌性乳腺炎新型疫苗的研究提供了一定的参考数据。     

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。     

羊种布鲁氏菌Rev.1突变株在BALB/c鼠中的免疫保护评价

为评价Rev.1-ΔKan-Vir B12突变株在BALB/c鼠中的免疫保护力,以Rev.1为参照,用Rev.1-ΔKanVir B12接种BALB/c小鼠,免疫45 d后用布鲁氏菌16M强毒株攻毒,15 d后取BALB/c鼠脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。结果显示:BALB/c鼠免疫攻毒15 d后,Rev.1-ΔKan-Vir B12免疫组和Rev.1免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P0.05),而Rev.1免疫组与Rev.1-ΔKan-Vir B12免疫组之间的克脾指数差异不显著(P0.05)。结果表明,羊布鲁氏菌Rev.1-ΔKan-Vir B12突变株与其亲本Rev.1株的免疫保护性无明显差异,具备作为布鲁氏菌病标记疫苗的潜力。     

中国罗非鱼主养区无乳链球菌流行菌株的菌毛岛屿及其血清型分型

为了解近年来中国罗非鱼主养区无乳链球菌流行特征,本研究通过PCR扩增和测序等方法对2007年~2016年分离纯化得到的263株罗非鱼无乳链球菌进行菌毛岛屿和血清型分型分析。菌毛岛屿分型结果显示:263株罗非鱼无乳链球菌可分为两种菌毛岛屿类型:PI-2b型(40株)和PI-1+PI-2b型(218株),其中PI-1+PI-2b型无乳链球菌是主要的流行菌株,占总数的82.9%。其余5株无乳链球菌的菌毛岛屿基因缺失,不含菌毛岛屿。分子血清型分析结果显示,所有的无乳链球菌分为两种血清型:Ia型258株(98.1%)和Ib型5株(1.9%)。所有Ib型无乳链球菌的菌毛岛屿均有缺失,仅含有2b-AP1基因。进一步分析表明,Ia-(PI-2b)型无乳链球菌是2011年之前主要的流行株型,而Ia-(PI-1+PI-2b)型无乳链球菌为近6年来广泛流行的株型。Ia型是我国罗非鱼无乳链球菌最流行的分子血清型,同时PI-2b是最重要的菌毛岛屿(98.1%)。本研究为罗非鱼无乳链球菌的流行病学和疾病防控提供调查依据。     

表达H1N1、H3N2猪流感病毒HA基因重组质粒在小鼠的免疫效力

应用已构建的真核表达质粒pCI-H1-HA、pCAGGS-H1-HA、pCI-H3-HA和pCAGGS-H3-HA作为DNA疫苗，利用BALB／c小鼠进行免疫保护试验，通过测定不同免疫期HI抗体滴度、分析攻毒后BALB／c小鼠体重变化及肺脏病毒含量，评价DNA疫苗的免疫效力。结果表明：构建的DNA疫苗均可诱导小鼠产生免疫力；BALB／c小鼠体重变化统计学分析显示，免疫组与对照组差异极显著（P〈0．01），pCAGGS表达载体构建的DNA疫苗免疫效果优于pCI表达载体构建的DNA疫苗（P〈0．05）。     

科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌cylE基因的克隆及抗原性分析

克隆分析科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌溶血素cylE基因片段,为深入研究奶牛乳腺炎无乳链球菌免疫机制及制备新型免疫抗原提供理论依据。根据GenBank已公布牛源无乳链球菌溶血素的基因序列,使用Primer5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板扩增cylE基因片段,并分析其编码序列及免疫活性。克隆得到的cylE基因序列与Genbnak已公布的牛源无乳链球菌cylE基因序列两者核苷酸序列相似性为99.9%,仅有1个核苷酸发生突变(¹⁷¹²C→A)。cylE蛋白的亲水区较广,抗原指数较高的区域丰富,具有良好的抗原性,证明cylE基因具有高度保守性,cylE蛋白具有良好的抗原性,是防治无乳链球菌的理想抗原候选分子之一。     

奶牛乳房炎多联苗抗原配比及抗人工感染试验的研究

为了进一步提高乳房炎多联苗免疫效果及评价疫苗免疫后的抗感染效果,试验从临床型乳房炎患牛奶样中分离、筛选出毒力及交叉免疫原性强的无乳链球菌(W271)、停乳链球菌(T2531)和金黄色葡萄球菌(J84184)3株优势血清型菌株,制备每剂量(5 mL)中含3种菌的抗原浓度分别为2.5×109CFU、5×109Cfu、1×1010CFU和2×1010CFU的4种氢氧化铝灭活多联苗,将每种疫苗于肩胛部肌肉免疫4头牛,每头牛免疫2次(0天和14天),每次5 mL,分别于免疫前后第28天采血,用间接ELISA方法检测免疫前后血清抗体水平.结果表明:免疫剂量与抗体效价具有显著相关性,随着菌苗中3种菌抗原浓度的增加,免疫后的3种菌血清抗体水平亦增加;用检验用的无乳链球菌(W117)、停乳链球菌(T1030)和金黄色葡萄球菌(J88014)进行免疫攻毒保护试验,结果血清抗体效价与免疫攻毒保护效果具有显著相关性,当免疫后抗体水平达到免疫前的2倍以上时,免疫后的奶牛即具有较好的保护效力.     

间接ELISA检测奶牛乳房炎疫苗保护效果方法的建立

本研究通过对细胞抗原制备、最佳抗原包被浓度的确定、抗原包被和封闭最佳条件确定、酶标抗体的最佳工作浓度及作用时间等反应体系的筛选和确定,建立了检测抗乳房炎疫苗抗体的间接ELISA方法.结果表明,金黄色葡萄球菌、无乳链球菌抗原、停乳链球菌最佳包被浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、10μg/mL:包被条件为4℃过夜:用2%人血白蛋白作为封闭剂最佳封闭条件是37℃封闭30min;酶标抗体最佳作用时间为30min.攻毒试验表明,疫苗免疫后,血清中抗体滴度达到或超过免疫前2倍时,对奶牛乳腺即具有较好的保护效力.这一指标可作为疫苗效力检验的标准.     

副猪格拉瑟菌6个候选抗原对小鼠的免疫特性分析

旨在获得具有良好免疫效果的候选抗原,本研究原核表达了副猪格拉瑟菌6个具有潜在保护力的蛋白,对小鼠免疫后进行攻毒,以期筛选获得具有免疫保护效果较好的候选抗原,从而为开发具有交叉保护作用的副猪格拉瑟菌亚单位疫苗奠定基础。63只BALB/c小鼠随机平均分为9组：HPSNAG-1330、CyaY、HPSNAG-0978、HPSNAG-0140、AfuA以及Fe³⁺ABC-tbp 6个亚单位疫苗组、G.parasuis-5灭活苗组、攻毒对照组和空白组;亚单位疫苗组每种对应蛋白各免疫50μg·只^-1,灭活苗组免疫4×10⁹CFU,一免与二免间隔14 d,二免14 d后攻毒,副猪格拉瑟菌Nakasaki菌株攻毒剂量为1.26×10⁹CFU。在二免14 d后检测特异性抗体水平、淋巴细胞增殖和IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达,攻毒后观察小鼠的临床症状并观察肺、脾的组织病理变化。免疫组小鼠均能产生体液免疫反应;淋巴细胞增殖试验显示：除rAfuA外,其它重组蛋白均能刺激灭活苗组中小鼠淋巴细胞显...     

牛源多杀性巴氏杆菌新型交叉保护性抗原的筛选

为了筛选多杀性巴氏杆菌潜在的交叉保护性抗原,首先对牛源多杀性巴氏杆菌PmCQ2株(A型)、PmCQ6株(A型)、PmB株(B型)、PmF株(F型)全基因组序列进行分泌蛋白及膜蛋白预测,并使用Signal、TMMHM在线分析筛选到48个候选共有抗原基因;然后分别克隆于pET-28α中构建原核重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测获得31个重组表达蛋白。间接ELISA检测重组蛋白对3种不同血清型牛多杀性巴氏杆菌多抗的反应原性,发现13个重组蛋白具有较强的反应原性。最后选择5个重组蛋白免疫小鼠后,分别采用10LD50PmCQ2、PmB和PmF进行攻毒保护性试验,结果显示:r-PmCQ2_1g0376免疫后的小鼠对PmCQ2和PmB的攻毒保护率为50%和30%,对PmF则没有保护性;r-PmCQ2_4g0132免疫后对PmCQ2、PmB和PmF株的攻毒保护率分别为80%,20%和10%;r-PmCQ2_1g0311免疫后的小鼠对PmCQ2的攻毒保护率为30%,对PmB和PmF株均无保护性。本试验筛选出2个交叉保护性抗原,可以不同程度保护同源或异源菌株的攻击,为多杀性巴氏杆菌新型疫苗候选蛋白的筛选奠定了基础。     

不同佐剂乳牛乳腺炎多联灭活疫苗的免疫试验

用4种不同佐剂乳牛乳腺炎多联疫苗进行兔免疫攻毒试验。结果，蜂胶疫苗效果最好，铝胶疫苗次之。对昆明系小白鼠注射蜂胶疫苗和铝胶疫苗后第30d金黄色葡萄球菌抗体水平达到最高，无乳链球菌和停乳链球菌抗体在第21d达到峰值。在免疫健康泌乳牛的试验中，3种佐剂疫苗的免疫效果依次为蜂胶疫苗、油疫苗和铝胶疫苗；与对照组相比，免疫效果均显著(P＜0．05)。     

PCV2a/2b灭活疫苗与PCV2b亚单位疫苗免疫效力比较试验

比较猪圆环病毒(PCV)2a、PCV2b基因型全病毒灭活疫苗和PCV2b亚单位疫苗对PCV2b基因型强毒株免疫攻毒保护效力。取3种类型PCV2疫苗,分2次免疫PCV2抗原和特异性抗体阴性的BALB/c小鼠和14日龄仔猪,间隔21d,分别于免疫后14、21和35 d进行PCV2特异性ELISA抗体测定。使用临床分离鉴定的PCV2b基因型强毒株进行攻毒,通过攻毒前后临床观察、体温变化、平均相对日增重及PCV2核酸载量检测等对疫苗免疫效果进行评价。结果:不同类型PCV2疫苗免疫BALB/c小鼠后14 d能检测到PCV2特异性抗体,在35 d时抗体水平持续升高,其中PCV2b亚单位疫苗产生抗体水平高于全病毒灭活疫苗;不同类型疫苗均能刺激仔猪产生较好的免疫应答,其中PCV2b亚单位疫苗刺激机体免疫应答强于灭活疫苗;仔猪免疫攻毒试验表明,3种类型疫苗均可刺激机体产生抵御PCV2强毒攻击的特异性免疫应答,免疫组体温变化、相对日增重及PCV2核酸载量检测均与攻毒对照组间存在显著性差异,3种类型疫苗之间差异不显著。试验表明:3种类型PCV2疫苗免疫小鼠和仔猪后均能诱导产生抵御PCV2b基因型强毒攻击的特异性免疫应答反应,有效抵抗PCV2感染和提高猪的生长性能。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著（P〈0.05）,而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

BALB／c小鼠无乳链球菌性乳腺炎模型的建立

目的：本试验用隐性乳腺炎患牛奶样中分离到的无乳链球菌制成细菌悬液，通过乳头管将细菌悬液注入泌乳母鼠乳池内，诱发小鼠乳腺炎，在此基础上研究乳腺炎的发病机制。方法：在建立小鼠乳腺炎标准动物模型的基础上，通过细菌计数、组织学、组织化学、免疫组化技术及酶联免疫吸附试验等方法研究了乳腺炎模型中无乳链球菌感染诱发的乳腺免疫反应。结果：母鼠乳腺攻毒后，乳腺组织主要以不同程度的渗出性变化为特点，低剂量组腺泡上皮细胞发生轻度的脂肪变性，随着无乳链球菌接种剂量的增大，腺泡上皮细胞发生严重的脂肪变性以至部分腺泡上皮细胞溶解，乳腺明显充血，腺泡中散在嗜中性粒细胞。攻毒10^4CFU无乳链球菌组中肥大细胞和树突状细胞的数目比10^3CFU组明显增多，而10^5CFU组呈下降趋势。乳腺组织中IFN-γ、TNF—α含量变化在各组中类似于细胞数目变化。结论：选用10^4CFU／50μL作为攻毒剂量研究乳腺发病机制并建立标准动物模型。     

重组产单核细胞李斯特菌溶血素的应用研究

李氏杆菌溶血素(Listeriolysin,LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子,为探索LLO的免疫保护性和作为诊断抗原的可行性,本研究用重组LLO抗原和单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)全菌分别免疫BALB/c小鼠和家兔,定期采血,ELISA检测抗LLO的抗体水平,并分别对免疫和对照动物攻毒致死剂量的LM,分析重组LLO抗原的免疫保护性。结果表明,小鼠和家兔在二免后10~20 d内LLO的抗体即可达到峰值,而且免疫动物能有效抵抗LM的感染。因此,重组LLO不仅可以用作动物LM的诊断抗原,而且具有作为基因工程疫苗的潜力。