多杀性巴氏杆菌CRISPR-Cas系统生物信息学分析

【目的】了解多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统的结构特征及cas基因的分布,为不同CRISPR亚型的应用及多杀巴氏杆菌的抗病毒进化研究提供基础。【方法】通过CRISPRCasfinder在线网站筛选多杀性巴氏杆菌基因组中的CRISPR簇和cas基因;通过生物信息学方法对各亚型系统中repeat和spacer序列保守性、repeat二级结构、cas基因核苷酸序列保守性、CRISPR簇相似性等进行分析。【结果】在选取的19株多杀性巴氏杆菌基因组中均存在Ⅰ-F、Ⅱ-C、Ⅲ-A亚型CRISPR系统。在相同亚型的CRISPR系统中repeat序列有着较保守的回文重复序列,但在不同CRISPR亚型中repeat序列差异较大。Ⅱ-C亚型的tracrRNA可以与crRNA形成保守的结构。在各亚型CRISPR系统中,新获取的spacer序列可以插入到CRISPR簇的5′-端、3′-端或中间位置。通过对各菌株spacer序列分析发现,在菌株内或菌株间的CRISPR序列中均存在着相同的spacer序列,这可能与细菌在遗传进化过程中repeat-spacer发生序列重组或基因水平转移产生的趋同进化有关。...     

嗜冷黄杆菌CRISPR/Cas系统生物信息学分析

为了开发基于嗜冷黄杆菌CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术,本研究对嗜冷黄杆菌的CRISPR/Cas系统结构及其作用机制进行生物信息学分析。从GenBank数据库中获得8株嗜冷黄杆菌的全基因组序列,利用CRISPRCasFinder软件查找成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）结构和CRISPR相关（Cas）蛋白在嗜冷黄杆菌基因组上的数量和分布;利用CRISPRFinder软件分析CRISPR结构的重复序列和间隔序列,并使用Mega X软件对cas基因核苷酸序列做相似性对比;通过与重复序列配对,获得反式激活crRNA （trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA）与重复序列配对序列,使用ARNold软件预测tracrRNA基因的终止子;使用BPROM软件预测tracrRNA基因和crRNA前体（pre-CRISPR RNA,pre-crRNA）的启动子;使用Clustal X软件对所有的间隔序列做相似性对比,并使用CRISPRTarget软件对独特的间隔序列配对从而获得原间隔序列（protospacers）及原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif,PAM）序列;使用WebLogo软件使PAM序列可视化。结果显示,8株嗜冷黄杆菌均含有1个完整的CRISPR/Cas9系统,由1个CRISPR结构和3个Cas蛋白组成。CRISPR结构由短而重复的序列即重复序列和短而可变的序列即间隔序列相间排列组成;重复序列大小为46 bp,核苷酸序列高度保守;间隔序列大小在29~31 bp之间,数量在20~41个之间。Cas蛋白含有Cas9、Cas1和Cas2,并且cas基因核苷酸序列高度保守。8株嗜冷黄杆菌的tracrRNA基因均位于cas9基因上游并且核苷酸序列相似性为100%。tracrRNA上有一段大小为24 bp的核苷酸序列,其中23个核苷酸与重复序列完全配对。每个重复序列均含有一个较短的启动子,可单独启动pre-crRNA的转录。不同菌株的间隔序列比对结果表明,新获得的间隔序列可以插入到嗜冷黄杆菌CRISPR结构的5'端或内部。在65个独特的间隔序列中,13个间隔序列能够配对上原间隔序列,这些原间隔序列均来源于噬菌体或质粒。原间隔序列上游侧翼序列分析结果表明,嗜冷黄杆菌Cas9识别的PAM序列是5‘-GANTTTT-3’。以上结果表明嗜冷黄杆菌的CRISPR/Cas9系统理论上可以开发适用于嗜冷黄杆菌的基因组编辑技术。     

15株禽源空肠弯曲菌的分离鉴定及CheW基因序列分析

为了解四川地区禽源空肠弯曲菌流行菌株的感染情况及其Che W基因的变异特点,本研究于四川地区采集禽源盲肠及内容物对空肠弯曲菌进行分离并纯化培养,将分离菌株进行染色镜检、生化试验、16S r RNA基因PCR鉴定,并对分离株的Che W基因进行克隆测序,选取Gen Bank中登录的10株国内外空肠弯曲菌菌株与分离株进行Che W基因的序列分析及遗传进化分析。结果显示:分离株经纯化培养于哥伦比亚血琼脂培养基上后出现无溶血现象的菌落;革兰染色为阴性;生化代谢类型较稳定且与相关报道一致;16S r RNA基因序列与空肠弯曲菌(NCTC11168、YQ2210)等菌株同源性为99%以上。15株分离菌株的Che W基因的核苷酸序列与所选参考株一致性为98.68%,其推导的氨基酸序列同源性一致性在98.9%以上。其中鹌鹑源分离株CJ-1、CJ-2、CJ-4、CJ-13、CJ-14在第22位和161位均出现单个碱基的置换为A→G。本实验中分离菌株均为空肠弯曲菌且分离菌株之间Che W基因保守性强,遗传变异动态性较弱。本研究为空肠弯曲菌遗传变异方面的相关动态研究提供参考依据。     

CRISPR-Cas9基因编辑系统研究进展

由规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)组成的CRISPR-Cas系统是细菌一种重要的获得性免疫系统。经改造的CRISPR-Cas9系统可在真核生物和原核生物、病毒等基因组内实现目的基因的插入、缺失。尽管由于受到单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)识别序列具有特异性的限制,同时一些物种基因结构存在复杂性和特异性,在基因编辑过程中会出现脱靶现象,在一定程度上限制了CRISPR-Cas9系统更加广泛的应用。但是,CRISPR-Cas9系统已经展现出很强的基因编辑能力,提升科研人员基因编辑的能力,是一项极具有应用潜质的新技术。论文主要阐述了CRISPR-Cas9系统结构、组成、设计策略和应用等方面研究进展,为相关科学的研究提供参考。     

O157∶H7型大肠埃希菌CRISPR/Cas系统结构的生物信息学分析

为了解O157∶H7型大肠埃希菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)分布和结构特征及cas基因分布情况,本试验通过GenBank数据库和CRISPRdb database获得92株O157∶H7型大肠埃希菌全基因组序列、CRISPR位点位置、CRISPR的侧翼序列及cas基因簇的序列范围,利用多序列比对、启动子预测和RNA二级结构预测等方法分析细菌中CRISPR系统的特点。结果显示,O157∶H7型大肠埃希菌的基因组存在3个CRISPR位点(CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3),每个CRISPR位点上的序列一致;CRISPR1和CRISPR2的重复序列可形成茎环状结构,环上的碱基易发生变化;CRISPR2中存在一段长451 bp的序列(命名为序列X),该序列X将CRISPR2分为2个部分CRISPR2a和CRISPR2b,其碱基A和T比例为74%,在91株O157∶H7型大肠埃希菌中均存在该序列,在该序列中可预测出至少有1个启动子和9个转录因子结合位点;侧翼序列中的疑似前导序列位于CRISPR2下游,序列长340 bp,其碱基A和T比例为69%,在92株O157∶H7型细菌中均存在该序列,其可预测出至少有1个启动子和3个转录因子结合位点;在20株O157∶H7型大肠埃希菌的全基因组序列中,有15株具有完整的cas基因簇,有5株缺乏cas3基因。本试验结果表明,O157∶H7型大肠埃希菌的CRISPR系统结构稳定,序列具有较高保守性,cas基因簇也相对保守。CRISPR2的结构与其他类型大肠埃希菌有较大差别。本研究发现的序列X在O157∶H7型大肠埃希菌分布广泛且序列保守,可作为鉴定O157∶H7型大肠埃希菌的潜在分子靶标。     

O157∶H7型大肠埃希菌CRISPR/Cas系统结构的生物信息学分析

为了解O157∶H7型大肠埃希菌中成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）分布和结构特征及cas基因分布情况,本试验通过GenBank数据库和CRISPRdb database获得92株O157∶H7型大肠埃希菌全基因组序列、CRISPR位点位置、CRISPR的侧翼序列及cas基因簇的序列范围,利用多序列比对、启动子预测和RNA二级结构预测等方法分析细菌中CRISPR系统的特点。结果显示,O157∶H7型大肠埃希菌的基因组存在3个CRISPR位点（CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3）,每个CRISPR位点上的序列一致;CRISPR1和CRISPR2的重复序列可形成茎环状结构,环上的碱基易发生变化;CRISPR2中存在一段长451 bp的序列（命名为序列X）,该序列X将CRISPR2分为2个部分CRISPR2a和CRISPR2b,其碱基A和T比例为74%,在91株O157∶H7型大肠埃希菌中均存在该序列,在该序列中可预测出至少有1个启动子和9个转录因子结合位点;侧翼序列中的疑似前导序列位于CRISPR2下游,序列长340 bp,其碱基A和T比例为69%,在92株O157∶H7型细菌中均存在该序列,其可预测出至少有1个启动子和3个转录因子结合位点;在20株O157∶H7型大肠埃希菌的全基因组序列中,有15株具有完整的cas基因簇,有5株缺乏cas3基因。本试验结果表明,O157∶H7型大肠埃希菌的CRISPR系统结构稳定,序列具有较高保守性,cas基因簇也相对保守。CRISPR2的结构与其他类型大肠埃希菌有较大差别。本研究发现的序列X在O157∶H7型大肠埃希菌分布广泛且序列保守,可作为鉴定O157∶H7型大肠埃希菌的潜在分子靶标。     

乌鬃鹅a干扰素基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从乌鬃鹅肝脏中扩增a干扰素（Interferon,IFN-a）基因片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用生物信息学软件Lasergene v7．1DNAStar和在线分析方法对IFN—a基因的核苷酸序列及其氨基酸序列进行了生物信息学分析,同时与GenBank中登录的鸡、鸭和鹅IFN．仅基因核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明,所扩增的IFN—a基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576bp,与鸡、鸭与鹅IFN-a基因核苷酸序列同源性在72．0％～99．7％,遗传进化树显示鸡、鸭、鹅IFN-a因在遗传进化上各处一支。乌鬃鹅IFN-a基因的克隆及生物信息学分析为进一步研究鹅干扰素抗病毒的作用机理奠定基础。     

温和气单胞菌CRISPR位点的检测与分析

为检测3株温和气单胞菌中是否存在CRISPR,采用PCR方法扩增3株菌的CRISPR序列,并利用生物信息学方法分析和预测了重复序列(direct repeat,DR)的同源性及二级结构。结果显示,3株温和气单胞菌中可信CRISPR个数为1,总长度为2 805bp,并含有42条间隔序列;可疑CRISPR个数为3,总长度为384bp。对可信CRISPR的DR二级结构预测发现,可形成发夹环,且头环由15个碱基构成,茎环含有5个碱基。在CRISPR BLAST中对测序结果进行同源性比对时发现,除多数同属或同种外,DR与嗜热螺旋体DSM 6192菌株、暗网菌属等远缘菌种均具有较高的同源性,且置信值为1;这说明温和气单胞菌株的CRISPR序列存在水平基因转移,并可能存在其他的进化进程。     

马流产沙门氏菌新疆分离株FliC基因的克隆及分子特征分析

为了解马流产沙门氏菌新疆分离株的分子特征及其鞭毛蛋白FliC基因的结构与功能,本试验运用PCR技术扩增了分离鉴定的2株马流产沙门氏菌新疆株FliC基因,克隆测序并对其进行了生物信息学分析。分析结果显示,成功获得了626 bp的FliC基因(GenBank登录号:KJ486797、KJ486798)。对分离的2株马流产沙门氏菌FliC基因的核苷酸序列同源性分析结果显示,FliC基因新疆分离株与GenBank登录的其他沙门氏菌分离株的核苷酸序列同源性为49.6%～100.0%。该结果表明马流产沙门氏菌的FliC基因在该菌进化和流行的过程中是保守的,本研究将为分析该病的分子流行和进一步利用FliC基因防制该菌引起的感染提供试验基础。     

猪伪狂犬病病毒gD基因的生物信息学分析

自测12条PRV不同毒株的gD全序列连同GeneBank中登录的9条gD基因全序列共21条基因序列,使用生物软件对它们的基因序列的同源性、突变区域的定位、遗传进化关系、酶切位点的差异、密码子偏爱性,氨基酸序列的同源性、蛋白质亲水性、抗原表位分析、三级结构预测等生物信息学的内容进行预测和分析.结果表明:PRV-gD基因的开放阅读框的核苷酸长度在1 197～1 215 nt之间,氨基酸长度在399～405个之间,核酸同源性在97.3%～100%之间,氨基酸的同源性在89.8%～98.8%之间,在核酸820～837位有个高变重复区,不同毒株基因均对GC极为偏爱.在遗传进化关系上将我国PRV流行分为四川、华北、东南3个区域.毒株间基因内酶切位点、蛋白质亲水性、抗原表位和蛋白质高级结构预测等内容的分析结果十分相似,说明PRV-gD基因具有很高的保守性.     

Vero细胞nucleolin和fibrillarin基因的克隆及序列分析

为克隆及分析Vero细胞的nucleolin和fibrillarin基因,本研究根据人类的相关基因设计两对引物,从Vero E6细胞中扩增nucleolin和fibrillarin基因。测序结果显示nucleolin基因序列长度为2 139 bp,编码712个氨基酸;fibrillarin基因序列长度为969 bp,编码322个氨基酸。与GenBank中登录的人类相应序列相似性高达97%,处于同一进化分支,表明该基因具有种属特异性并且保守性很高;同时利用软件对nucleolin和fibrillarin预测蛋白进行了生物信息学分析,从而为研究冠状病毒核蛋白与核仁蛋白相互作用奠定了基础。     

莱航鸡rDNA重复基因家族的克隆

动物rDNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。通过结合生物信息学技术,经反复摸索后选用LAPCR法扩增莱航鸡rDNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了莱航鸡的3个rDNA基因及其2个间隔序列。研究对克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等进行了探索。     

赣南地区柑橘黄龙病菌遗传多样性分析

为探究赣南地区柑橘黄龙病菌的遗传多样性。从赣南16个县市区采集32个具典型柑橘黄龙病症状的脐橙样品,运用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析)技术研究了柑橘黄龙病菌16S rDNA序列、16S/23S rDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因的遗传多态性;并对三个基因片段进行测序,分析其序列的碱基含量、转换与颠换、同源性、核苷酸遗传距离和系统进化特征。RFLP结果表明：赣南16个县市区柑橘黄龙病菌XbaⅠ酶切图谱均与亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）的一致;进一步分析显示,三个基因片段各自之间的RFLP指纹图谱一致,并未表现多态性。序列分析结果表明：32个分离物三个基因片段各自的同源性均在98%~100%,与CLas的同源性最大,且与CLas的遗传距离最小。系统进化树展示赣南地区柑橘黄龙病菌与CLas处于同一分支,结合酶切图谱、序列同源性及系统进化分析结果表明： 赣南地区柑橘黄龙病菌均为CLas。结论：赣南地区柑橘黄龙病菌的16S rDNA序列、16S/23S rDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因未表现遗传多样性,表明赣南地区柑橘黄龙病菌间遗传多样性不显著。 关键词：柑橘黄龙病;16S rDNA序列;核糖体蛋白基因;16S/23S rDNA间隔区;RFLP;序列分析     

基于CRISPR-Cas系统的病原体检测研究进展

开发快速、灵敏、特异的检测方法对于新发突发人兽共患病、动物疫病的监测及防控至关重要。规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统以高敏感性、特异性及可扩展性的DNA和RNA识别为特点,已成为新一代的分子诊断工具,在病原体快速检测技术研发中得到广泛应用。在新型冠状病毒肺炎疫情中,基于CRISPR-Cas系统开发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测试剂盒(SHERLOCK和DETECTR)在美国相继获批,中国研发的基于CRISPR-Cas12系统的SARS-CoV-2检测试剂盒也已获批上市,这表明基于CRISPR-Cas系统的病原体检测方法在未来的应用前景非常可观。文章首先简述了CRISPR-Cas系统类型,尤其是常用于病原体检测的Cas9、Cas12和Cas13;介绍了CRISPR-Cas系统的作用机理以及广泛应用。同时分析了CRISPR-Cas检测平台研发的关键技术问题,包括靶标基因的序列保守性、靶标基因的富集与扩增、终信号不同的读取方式等,并对CRISPR-Cas系统的未来发展及应用前景进行了展望。     

马源马链球菌兽疫亚种新疆株的分离鉴定及遗传特性分析

为了解马源马链球菌兽疫亚种（S.zooepidemicus）新疆分离株马链球菌兽疫亚种类M蛋白（SzM）基因的分子进化与变异情况,为该菌引起的感染性疾病的防控提供依据,本试验对新疆地区某马场采集的病马淋巴结样品进行病原菌的分离培养和生化鉴定,并对分离菌株进行药物敏感性试验。根据已发表的马源SzM基因序列设计引物,对其SzM基因进行PCR扩增及序列测定。将获得的SzM序列与GenBank中不同动物源马链球菌兽疫亚种分离株序列进行同源性比对和遗传进化分析。结果显示,分离得到了一株革兰氏阳性链球菌,将其命名为马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对青霉素、磺胺嘧啶钠耐药,对其他14种药物均敏感。序列分析结果显示,马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与国内外不同动物源分离株SzM基因氨基酸同源性为56.0%~70.0%。遗传进化分析结果显示,这些菌株可分为4个群。马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与猪源分离株SzM蛋白的氨基酸同源性为59.9%,分别属于2个不同的群,其与美国马源分离株NH55426亲缘关系最近。本试验结果可丰富国内马源马链球菌兽疫亚种SzM基因的信息数据,为马链球菌兽疫亚种的致病机制研究和预防控制提供参考依据。     

马源马链球菌兽疫亚种新疆株的分离鉴定及遗传特性分析

为了解马源马链球菌兽疫亚种(S.zooepidemicus)新疆分离株马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzM)基因的分子进化与变异情况,为该菌引起的感染性疾病的防控提供依据,本试验对新疆地区某马场采集的病马淋巴结样品进行病原菌的分离培养和生化鉴定,并对分离菌株进行药物敏感性试验。根据已发表的马源SzM基因序列设计引物,对其SzM基因进行PCR扩增及序列测定。将获得的SzM序列与GenBank中不同动物源马链球菌兽疫亚种分离株序列进行同源性比对和遗传进化分析。结果显示,分离得到了一株革兰氏阳性链球菌,将其命名为马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对青霉素、磺胺嘧啶钠耐药,对其他14种药物均敏感。序列分析结果显示,马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与国内外不同动物源分离株SzM基因氨基酸同源性为56.0%～70.0%。遗传进化分析结果显示,这些菌株可分为4个群。马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与猪源分离株SzM蛋白的氨基酸同源性为59.9%,分别属于2个不同的群,其与美国马源分离株NH55426亲缘关系最近。本试验结果可丰富国内马源马链球菌兽疫亚种SzM基因的信息数据,为马链球菌兽疫亚种的致病机制研究和预防控制提供参考依据。     

基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立

采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统，建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列，选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物，并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化，建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取10⁵～1 copies·μL^-1含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明，本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏，其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^-1)2.0μL、crRNA(100μmol·L^-1)3.2μL、TaqMan...     

山羊CLAⅠα链基因的克隆及生物信息学分析

为探究山羊CLAⅠα链基因的多态性,本试验根据GenBank中山羊CLAⅠα链基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从10个品系山羊白细胞中克隆山羊CLAⅠα链基因,测序后进行生物信息学分析。结果表明,CLAⅠα链基因长度为1 074bp,编码357个氨基酸。经核苷酸序列分析发现,10个品系山羊CLAⅠα链基因同源性集中在82.8%~99.5%之间。将10个品系山羊CLAⅠα链基因核苷酸推导的氨基酸序列进行比对,发现突变集中在α1区域(22—110位氨基酸)与α2区域(111—203位氨基酸)。遗传进化分析表明,GenBank中山羊CLAⅠα链基因与红寺湖绒山羊、河西绒山羊、陕北绒山羊、阿尔巴斯绒山羊的CLAⅠα基因遗传关系较近,与其他6个品系山羊,即简阳大耳山羊、金堂黑山羊、西农萨能奶山羊、美姑山羊、大足黑山羊、努比亚山羊的CLAⅠα基因遗传关系较远。本试验结果为进一步研究CLAⅠα链基因的多态性奠定了理论基础。     

猪博卡病毒的基因分型

为了解猪博卡病毒(PBoV)的遗传进化规律,研究可行的PBoV基因分型方法,本研究利用Gen Bank中登录的29条PBoV和2条本实验室测得的全基因组序列信息,采用生物信息学软件进行基因组序列分析。结果显示,分别以NS1基因、NP1基因和VP1基因编码氨基酸构建的系统进化树,PBoV均被划分为3个基因群,但三种氨基酸序列绘制的进化树存在差异;基因群内各病毒株的氨基酸序列同源性较高,而各基因群之间病毒株的氨基酸序列同源性非常低,基因组结构差异较大。     

牛病毒性腹泻病毒基因Ⅱ型HLJ-10分离株全基因组克隆及其序列特征分析

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分子特征,本研究参考GenBank中登录的BVDV基因Ⅱ型病毒株全基因组序列,设计多对引物,通过RT-PCR方法,对一株分离自某商品化血清中的BVDV分离株HLJ-10全基因组进行分段克隆及序列测定,获得了该分离株的全基因组序列。生物信息学分析表明,该分离株为BVDV基因Ⅱ型,全长12 284 nt,编码区为11 694 nt,共编码3 897个氨基酸,5’和3’非编码区分别为385 nt和205 nt。与其它BVDV参考株序列比对分析表明,HLJ-10与SH-28和KZ91CP进化关系较密切,预测该分离株含有22个潜在糖基化位点,氨基酸差异性分析表明E2蛋白的氨基酸序列在瘟病毒属中变异性较大。