鸭瘟病毒疫苗株UL44.5和UL44基因间隔区作为复制非必需区的鉴定

为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中适合外源基因插入的复制非必需区,本研究利用本实验室前期建立的DEV疫苗株多片段拯救系统,结合E/T克隆技术、LR克隆技术将含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的目的片段,定向插入到含DEV基因组复制非必需区的粘粒中,该位点位于DEV基因组UL区的UL44.5和UL44之间,拯救获得了重组病毒(rDEV)。通过PCR和荧光显微镜鉴定该重组病毒。结果显示,经PCR扩增,r DEV可以扩增到预期目的片段,观察可见红色荧光,表明RFP基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果显示,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。将r DEV以105 TCID50的剂量免疫SPF鸭后,DEV攻毒保护试验结果显示,r DEV和亲本株DEV活疫苗对SPF鸭的保护效率均为100%。本研究筛选到DEV基因组中的一个可供外源基因插入的位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗研制提供依据。     

TK基因缺失对鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞中复制影响的评价

为鉴定鸭肠炎病毒(DEV)的非必需基因,本研究利用增强型绿色蛋白(EGFP)基因为报告基因,通过在转染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,将其插入DEV基因组的TK基因中,经筛选和纯化绿色荧光病毒蚀斑,获得表达EGFP的重组DEV,命名为r DEVTK-EGFP。对重组病毒与亲本病毒DEV Clone-03复制动力学比较结果显示,重组病毒滴度显著低于亲本病毒(p0.01)。对重组病毒在复制过程中感染细胞能力和荧光表达时相检测结果表明,在感染后48 h~72 h表达荧光信号细胞明显增多,该结果与重组病毒复制动力学一致。将重组病毒在CEF中连续传代至20代,仍具有遗传稳定性。该研究结果表明,TK基因为DEV复制非必需基因,可以作为外源基因插入位点,用于禽用新型基因工程疫苗的研制。     

鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL~(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL~(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。     

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。     

鸭瘟病毒转移质粒的构建

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。     

鸭肠炎病毒us2基因转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2全基因(包含s3、us3部分基因),将扩增产物克隆入pMD18-T载体,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切连入pUC19载体,获得质粒pUC-us2.将完整的EGFP表达盒插入us2基因内BamH Ⅰ位点,得到转移载体质粒pUC-us2-EGFP.脂质体法将转移载体质粒pUC-us2-EGFP转染DEF细胞,观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得表达.     

重组鸭肠炎病毒载体疫苗研究进展

重组病毒载体疫苗是一种以减毒活病毒为载体承载表达其他病原抗原性基因的新型疫苗,能感染宿主细胞、递呈外源基因所表达的抗原蛋白、诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,从而有效地预防多种疾病。鸭肠炎病毒基因组长约160kb,包含多个非编码区和病毒复制非必需区,可携带多个或较大的外源基因,是构建重组活病毒疫苗的理想载体。随着分子生物学研究的不断深入和分子生物学实验技术的飞速发展,对鸭肠炎病毒基因组进行遗传修饰的技术手段已十分成熟,目前已通过这些技术成功构建了多株重组鸭肠炎病毒活载体疫苗。研究表明构建的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗可成功抵抗鸭肠炎病毒和其他相应病原的攻击,具有作为重组病毒疫苗载体的潜力,并在未来的禽类新型疫苗研制中发挥重要作用。本文对以鸭肠炎病毒作为载体的重组病毒活载体疫苗的研究进展进行综述,以期为鸭肠炎病毒载体疫苗的研发提供参考。     

表达新城疫病毒F基因重组鸭肠炎病毒的构建

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)F基因的重组鸭肠炎病毒(DEV),本研究以实验室前期构建的表达绿色荧光蛋白的重组DEV(r DEV-US10-EGFP)为基础,通过PCR扩增NDV F基因,构建了携带F基因表达盒的转移质粒p US10-TPA-F。将转移质粒与r DEV-US10-EGFP基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞。经过反向蚀斑筛选,获得表达NDV F基因的r DEV-US10-F。对重组区域US10基因测序结果表明,F基因正确插入至US10基因编码区内。将重组病毒传至15代,F基因仍能够稳定表达,表明重组病毒具有稳定的遗传特性,并且与亲本病毒株具有相似的生长曲线。本研究为研发NDV-DEV活载体疫苗奠定了基础。     

携带DEV-gB/NP28重组减毒沙门氏菌诱导鸭的免疫应答研究

为探究表达鸭肠炎病毒(DEV)gB/NP28双基因重组减毒沙门菌口服疫苗在鸭体内诱导免疫应答能力,本研究将构建的重组菌(pcDNA3.1-DEV-gB/NP28)/SL7207、DVE弱毒疫苗、重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB/NP28及PBS分别免疫雏鸭,通过间接免疫荧光法检测免疫鸭脾脏、胸腺、法氏囊、哈德氏腺组织中的抗原表达;双抗体夹心ELISA方法检测肠道黏膜sIgA;间接ELISA方法监测血清中DEV特异性抗体、外周血T淋巴细胞增殖及IFN-γ、IL-4细胞因子含量,对该口服疫苗进行免疫学评价。结果表明,重组菌能够诱导鸭产生良好的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答;攻毒试验显示,在DVE强毒攻击下重组菌免疫可提供75%以上的保护,表明重组菌免疫对DEV攻击具有一定的免疫保护作用。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

表达红色荧光蛋白的重组鸭肠炎病毒的构建及鉴定

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又称为鸭瘟病毒,是一种只感染雁形目禽类的疱疹病毒。DEV具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定等优点,其庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点,以DEV为载体,成功表达了禽流感病毒HA蛋白_^[1]、鸭病毒性肝炎病毒VP0蛋白_^[2]、鸭坦布苏病毒E基因_^[3]以及鹅细小病毒VP2蛋白_^[4]。构建重组DEV的重要一步是将报告基因插入到基因组中,目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及LacZ报告基团。本研究用RFP报告基团插入DEV UL2基因中,获得表达红色荧光的重组病毒,一步生长曲线表明,RFP对DEV的生长无影响;连续传代12代,RFP能够稳定表达,为DEV载体研究奠定基础。     

重组马立克病毒通用转移载体的构建及初步应用

本实验以独立启动子控制的增强型绿色荧光基因(GFP)作为报告基因,同时将CMV启动子及其多克隆位点与之连接,构成外源基因表达盒,插入到马立克病毒(MDV)复制非必需区基因(短独特区US2等)构成的同源臂中,构建成重组马立克病毒的通用载体。鉴定正确后,将转移载体与提取的MDV基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),同源重组获得具有感染性的重组病毒,待病毒蚀斑出现后,荧光显微镜下观察,可见到明显的绿色荧光病毒蚀斑,经三次筛选,初步分离到重组病毒。结果表明,转移载体与MDV基因组共转染可获得感染性病毒,US2基因可作为重组病毒构建中的外源基因插入位点,证实通用转移载体的构建是可行的,为重组马立克病毒新型疫苗的研究奠定物质基础。     

鸭肠炎病毒UL41基因缺失株的构建及其体外增殖能力分析

旨在构建鸭肠炎病毒（DEV）UL41基因缺失毒株,并对其生物学特性进行分析,本研究以克隆有DEV UL41基因的重组黏粒D1为骨架,利用Red/ET重组技术构建缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41;将UL41基因缺失重组黏粒D1 dUL41与其他4个克隆有DEV基因组片段的亲本黏粒共转染鸭胚成纤维细胞（DEF）,拯救获得UL41基因缺失毒株rDEV-SD19/dUL41。将该基因缺失病毒感染DEF后,提取病毒基因组进行PCR鉴定及测序,并利用间接免疫荧光试验检测该病毒感染细胞中UL41基因表达情况;绘制拯救的基因缺失病毒的生长曲线,分析其体外复制特性。PCR及测序结果显示,本研究成功构建了缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41。将该基因缺失黏粒与其他含有DEV基因组的亲本黏粒共转染DEF后能够产生典型的蚀斑病变。PCR及测序结果显示,UL41基因成功从DEV基因组中缺失;间接免疫荧光试验发现,基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41感染DEF后,未见UL41蛋白表达。综上表明,本研究成功构建了DEV UL41基因缺失病毒。体外生长曲线显示,rDEV-SD19/dUL41在DEF中的复制能力明显低于亲本病毒,提示UL41蛋白在DEV复制中发挥重要作用。UL41基因缺失DEV的构建为进一步研究UL41基因在DEV感染和致病中的作用机制奠定了基础。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。     

携带Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

为构建含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-30)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧...     

鸭肠炎病毒囊膜糖蛋白gE基因序列分析及真核表达载体的构建

为探索鸭肠炎病毒（DEV）囊膜糖蛋白gE基因的相关特性和功能,应用PCR扩增了DEV的gE基因,全长1473bp,编码490个氨基酸,其中1～22位氨基酸为信号肽。gE基因与国内分离强毒CHv株、国内疫苗株同源性均为100％,与德国分离强毒2085株同源性达到99％,显示其高度保守。将gE基因完整开放阅读框（gE）和去信号肽的gE基因（gE’）分别克隆至真核表达载体pCDNA3．1．获得重组质粒pCDNA3．1-gE、pCDNA3．1-gE,然后应用脂质体法转染vero细胞。RT—PCR扩增证实gE、gE’均在细胞内进行了转录,而间接免疫荧光试验证实只有gE’基因在veto细胞中获得了表达,h研究gE蛋白的功能及研制鸭瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

表达Ⅰ型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR快速检测鸭瘟病毒的研究

根据GenBank中鸭瘟病毒(DPV)UL6和UL7基因的保守序列,设计了一对特异性引物,扩增位于UL6和UL7基因第891～991位长度为101bp片断。以DPV标准强毒株DNA为模板,建立了SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒的方法,用该方法检测鸭瘟标准强毒、疫苗毒及野毒株均为阳性,检测其他受试的非鸭瘟病毒DNA均为阴性,对鸭瘟强毒和疫苗毒人工感染鸭胚尿囊液的检出率均为100%,对6个临床送检样本的检出率为6/6,与病毒分离鉴定结果一致;最小检出量为1.57×104拷贝/ul。