猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在多表达系统中的表达及初步应用

本研究分别用巴斯德毕赤酵母、杆状病毒和大肠杆菌表达系统中表达的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株纤突蛋白(S)基因5'端含有B和C抗原位点的片段,利用Dot-ELISA方法对表达蛋白进行了抗原性比较分析,初步建立了以巴斯德毕赤酵母系统表达的重组蛋白为包被抗原的TGEV Dot-ELISA检测方法。结果表明:两种真核系统中表达的重组蛋白的抗原性相对更强。抗原最佳包被量为50 ng,抗体稀释度1∶100,最适封闭液为10 mg/L牛血清白蛋白,血清反应时间为60 min;酶标二抗的工作浓度为1∶1 000,反应时间为30 min,底物在室温显色时间为5 min。本研究建立的Dot-ELISA方法对猪呼吸道冠状病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清的检测结果均为阴性,特异性良好。与Svanova TGEV/PRCV抗体诊断试剂盒比较,此方法的特异性和符合率分别为90%和87%。     

基于重组蛋白TPx的羊肝片吸虫感染Dot-ELISA检测方法的建立

利用大肠杆菌原核表达系统表达的羊肝片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPx)为诊断抗原,建立羊肝片吸虫感染Dot-ELISA检测方法。结果显示:重组蛋白约为30 000;各组分的最适反应条件为:抗原最适包被量为0.28μg/片,血清最佳工作浓度和工作时间分别为1∶400和30min,酶标二抗最佳工作浓度和工作时间分别为1∶800和45 min,血清和酶标二抗最佳反应温度均为37℃,最适封闭液和封闭条件分别为2%BSA-TBS和37℃2h,最佳显色时间30min。该方法特异性较强、灵敏度高、重复性好。运用该方法对浙江海宁和桐乡共200份羊血清样本进行检测,阳性率为1.5%。结果表明:本试验应用重组蛋白TPx通过PVDF(聚偏氟乙烯微孔)膜固相载体建立了羊肝片吸虫Dot-ELISA检测方法。     

水貂阿留申病毒VP2蛋白Dot-ELISA检测方法的建立

为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(CIEP)作对照试验。结果表明,抗原最适包被浓度为20μg/m L,最适血清稀释度为1∶200,酶标二抗最适工作浓度为1∶2 000,血清和酶标抗体最适反应温度为37℃,反应时间为45 min~60 min。阻断试验和交叉试验显示与常见的貂病毒性肠炎和貂犬瘟热阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。采用建立的Dot-ELISA和CIEP对78份临床血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA阳性检出率为84.6%,CIEP的阳性检出率为80.8%,敏感性高于CIEP,两者符合率为96.2%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异、重复性好,适合基层单位用于水貂阿留申病快速诊断和疫病普查。     

猪肺炎支原体融合蛋白MHP-P46-P36的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

利用生物学软件分析猪肺炎支原体P46蛋白和P36蛋白的抗原决定簇,将抗原表位富集区进行串联,表达融合蛋白MHP-P46-P36。以融合蛋白MHP-P46-P36作为包被抗原,优化反应条件建立肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示：融合蛋白MHP-P46-P36以可溶性形式高效表达;ELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度10 mg/L, 1%BSA封闭60 min,一抗最佳稀释度1∶40且37℃60 min,二抗最佳稀释度1∶4 000且37℃60 min,最适显色时长15 min, cut-off值为D_{450 nm}=0.385;与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性;阴阳性血清的组内和组间变异系数均小于7%,具有较好重复性;52个样品临床样本检测结果显示,建立的ELISA方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒相比,阳性样本的符合率为83.09%。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体NSP7-ELISA检测方法的建立

为了建立区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抗体和灭活疫苗免疫抗体的诊断方法,试验以重组表达蛋白NSP7为抗原,建立检测PRRSV抗体的NSP7-ELISA方法,并对最适反应条件进行确定,然后对猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清和采自长春市的150份血样样品进行检测。结果表明:NSP7-ELISA最佳工作条件为NSP7抗原的最适包被浓度2.0μg/m L,血清稀释度1∶40,酶标抗体的工作浓度1∶5 000,以5%脱脂奶粉封闭过夜;猪瘟病毒等5种猪常见病毒感染阳性血清的检测结果均为阴性;在150份血清样本检测中,敏感性、特异性和符合率分别为88.1%(37/42)、90.7%(98/108)、90.0%(135/150)。说明建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于区分PRRSV感染抗体和灭活疫苗免疫抗体。     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测.     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒双抗体夹心Dot-ELISA检测方法的建立

采用辛酸-硫酸铵法提取兔抗牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)高免血清中的免疫球蛋白IgG,辣根过氧化物酶标记提纯后IgG,建立了检测BVDV抗原的双抗体夹心斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)法。结果显示,抗体最佳包被量为300μg/mL,酶标记抗体的最适浓度为1∶50倍稀释,以5%牛血清作为封闭液、封闭45min效果最佳,抗原最小检出量是1.34μg/mL。应用建立的检测方法对河北省内78份腹泻奶牛血样进行了检测,阳性检出率为57.69%;经卡方检验分析,建立的Dot-ELISA与琼脂扩散(AGP)法相比较,阳性检出率差异显著。试验证明,该方法具有简便快速、特异性强、重复性高的优点,适合于基层兽医的检测诊断。     

应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将表达的禽呼肠孤病毒(ARV)σ3融合蛋白纯化后作为抗原,建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了摸索,确定了抗原的最适包被浓度为3.98μg/mL,检测血清最适稀释倍数为1∶200,血清与抗原反应最佳反应时间为37℃作用2h,酶标二抗最佳作用时间为37℃作用1h,底物的最佳显色时间为25min。包被的抗原不与新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等阳性血清发生交叉反应。用该方法建立的ELISA诊断方法,具有很好的敏感性和特异性,为ARV的诊断和检测以及血清学调查提供良好的技术手段。     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

检测猪等孢球虫抗体的间接ELISA方法的建立

以纯化的猪等孢球虫孢子化卵囊为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗,建立了检测猪等孢球虫抗体的间接ELISA方法。经检测筛选出最佳反应条件为:2.5μg/孔纯化的猪等孢球虫抗原包被酶标板;抗原最佳包被条件是37℃,2h;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶10000;血清、酶标二抗的作用时间分别为30min、45min。     

猪伪狂犬重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测猪伪狂犬病病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法。通过方阵滴定确定了抗原最适包被量为1.45μg/孔,血清最适稀释度为1∶80,其作用时间为60 min,酶标抗体最适作用时间为60 min。其阳性临界值为OD≥0.123。此外,该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%。该方法与进口诊断试剂盒的符合率为96.3%。本研究为现地免疫猪群抗体检测和进行PRV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

间接竞争性ELISA法快速诊断TGEV的研究

利用基因工程技术制备的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因原核表达产物重组N蛋白作为抗原诊断试剂,抗重组N蛋白的单克隆抗体作为抗体诊断试剂建立了间接竞争性ELISA检测细胞培养物中的TGEV病原的方法,并确定了间接竞争性ELISA操作流程中的最佳反应条件。在间接竞争性ELISA中,最佳抗原包被量为0．25卢g／孔;竞争抗原与单克隆抗体作用的最适时间为1h,反应温度为37℃;选择1h作为酶标抗体作用的最佳时间;底物液最佳作用时间为10min;选择样品的抑制率50％为其临界值;所用封闭液0．5％的聚乙烯醇PBS溶液在4℃冰箱中可密封保存6个月,封闭时间为120min;特异性试验表明与猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒等肠道腹泻性病毒均无交叉反应。本试验建立的间接竞争性ELIsA诊断方法具有良好的敏感性和特异性,为TGEV的疫情监测、及时而准确的诊断奠定了基础。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白抗原区的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在42 ku处出现特异性条带,表明r VP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以r VP2为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2μg/mL,5%脱脂乳的PBST作为封闭液37℃孵育1 h,待检血清的最适稀释度为1∶500,兔抗猪Ig G-HRP稀释度为1∶10 000,最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值<0.201时,样品检测结果为阴性;当检测样品的S/P值≥0.201时,结果为阳性。利用该方法检测SVA,猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清,结果显示,除SVA检测为...     

基于PEDV中国变异株S蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

以纯化的重组猪流行腹泻病毒(PEDV)中国变异株S蛋白为包被抗原,建立了检测PEDV流行株抗体的间接ELISA方法。所建方法最佳反应条件为:抗原最适包被量为1μg/孔,包被时间为37℃1h后4℃过夜;血清工作浓度为1∶100,作用时间为1.5h;二抗选用HRP标记的兔抗猪IgG稀释度为1∶4 000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用时间为15min;判定标准为,样品S/P值大于等于0.058判定为阳性,小于0.045判定为阴性。所建ELISA方法具有良好的特异性和重复性。对50份疑似猪流行性腹泻血清样品进行检测,该方法与PEDV病原检测结果有较高的符合率。结果表明本研究所建立ELISA方法可用于PEDV流行株抗体检测和疫病监测。     

猪圆环病毒2型抗体检测间接ELISA方法的建立

用纯化的重组猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被、血清及酶标二抗作用时间、底物的选择等),建立了检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。结果显示,重组抗原最适包被浓度为0.5mg/L,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度1∶160,酶标二抗工作浓度1∶7500,待检测血清和酶标二抗的反应时间均为37℃,45min,底物37℃显色10min。阻断试验表明,建立的间接ELSA对PCV2抗体具有很好的特异性。板内和板间重复试验显示,同1份血清板内各孔的变异系数均值为2.78%,板间同一份血清D值变化不大,表明重复性好。     

重组GP5AB蛋白间接ELISA检测PRRSV抗体方法的研究

利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。抗原最适包被浓度为2μg/mL,最佳封闭液为0.15%BSA,37℃封闭2 h后,再4℃封闭24 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60m in,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为90 m in,37℃显色10 m in,S/P≥0.284为阳性,S/P≤0.26为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果,变异系数均小于7%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品,并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较,结果显示3种抗原检测的结果基本一致。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起我国猪急性肠炎并水样腹泻的重要病原之一,但尚无商品化病毒血清抗体检测试剂盒。本研究以纯化的PEDV为包被抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了间接ELISA抗体检测方法,其反应条件为:抗原最佳包被浓度为3μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,包被时间为37℃作用2 h,1.5%BSA 37℃封闭3 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测6份已知PEDV阳性血清效价为1∶3 200,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数2.5%～8.3%,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,证明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。