荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究

试验对荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的分离、体外培养及5种冷冻保存方法进行了研究。结果表明:用DMEM/F12 20%胎牛血清 100IU/mL双抗的完全培养液进行组织块培养,能获得良好的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞原代培养物;成纤维细胞混合培养物经TrypsinEDTA(0.25%Trypsin,1mmol/LEDTA.4Na)消化所收集到的细胞主要为成纤维细胞,经2~3代传代,可得到纯化的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的条件下,选用5种不同的冷冻保存方法进行冷冻保存,其中使用70%细胞悬液 20%胎牛血清 10%DMSO的冷冻保存悬液,先在4℃预冷平衡0.5h,接着在液氮罐口的气态氮中悬挂4h,然后沉入液氮的方法冻存的细胞,解冻后,经台盼蓝染色后进行细胞活力分析,活细胞率为86.68%;培养48h后细胞贴壁率为86.40%,明显高于其他几种方法。     

波尔山羊耳成纤维细胞的分离培养与保存

本文研究了波尔山羊耳成纤维细胞的体外培养,包括分离纯化和生长特征,同时还研究了成纤维细胞的冷藏和冷冻保存.结果表明,波尔山羊耳成纤维细胞贴壁生长,一般经历潜伏期、指数增生期和平台期;4℃体外冷藏时间为5 d;冷冻保存时4℃平衡1 h、-80℃过夜,然后直接投入液氮中,解冻后培养得到61.6%的贴壁率.     

老年猪耳成纤维细胞建立及克隆胚胎发育

为保存江苏地方猪种的种质资源,通过采集猪耳结合低温运输进行老年猪耳组织块贴壁培养,建立猪耳成纤维细胞,进而将细胞扩繁传代并冷冻保存。通过规范采样流程,结合低温运输方式,使运输时间达到8h以上,扩大了采样范围,同时,使污染风险由前期的30.77%(13头)降低到目前的8.3%(12头)。虽然老年猪耳成纤维细胞在初期游离到铺满培养瓶需要21d,远高于胎儿(怀孕24d的胚胎)成纤维细胞,但其后期的冻存与解冻培养均不受影响。随后,利用手工克隆技术生产克隆胚胎,老年猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(27.04±4.08)%与新生猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(28.8±2.37)%相比,无显著差异(P>0.05)。本试验结果证明老年猪耳成纤维细胞培养及冻存的可行性,为利用体细胞与体细胞核移植对地方猪种种质资源的保存提供支持。     

转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系的建立及鉴定

本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。     

金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

试验以金华猪耳缘皮肤组织为材料,采用组织块贴壁法进行耳缘组织分离、培养、传代,并进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制等生物学特性研究。结果表明:金华猪耳缘组织成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为95.6%和93.8%;生长曲线呈"s"型。通过试验建立了稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞培养方法,说明组织块贴壁方法是获得成纤维细胞的简单有效方法,获得的细胞可在体外至少传代10代以上,能为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关研究提供核细胞来源。     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因（pGH/IGF-Ⅰ）猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。     

不同方法培养猪胎儿成纤维细胞的研究

随着畜禽资源保存,核移植、转基因动物胚胎学、遗传工程等研究工作的发展,猪成纤维细胞培养工作越来越受到重视。本试验采用胰酶消化法和组织块法培养了大量优质的猪胚胎成纤维细胞,并成功进行了冻存和复苏,建立了一套较完备,快速的猪胚胎成纤维细胞的培养模式。     

猪成纤维细胞冻存方法的研究

试验以猪的成纤维细胞为研究对象，认为在-70℃情况下冻存至少7d不会影响其存活率(可达80％以上)，且生长形态正常。同时利用血清饥饿法使成纤维细胞周期同步化，在-70℃冻存2d、4d和7d，细胞存涪率可达92．3％、87．2％和83．6％，甚至在该务件下冻存15d，细胞也能恢复正常的生长。     

山羊小肠上皮细胞冻存与复苏的试验研究

在体外细胞培养工作中,为了保种和长期保存其生物活性,细胞的冷冻与复苏成了一个重要的环节.对于体外培养的细胞,必须能够以一种较高的效率实现冻存与复苏,才能达到组织工程种子细胞的要求.试验采用不同的冻存液、不同的冻存速率对体外分离培养的山羊IEC进行冻存与复苏,旨在提出最佳的冻存复苏方案.     

干细胞的研究和利用

干细胞是指分化程度低、多潜能的细胞 ,主要指胚胎细胞和幼稚细胞。人们对干细胞的研究和利用是基于细胞发育的全能性以及干细胞分化多潜能的特性。目前 ,对干细胞的研究引起各方面的强烈关注。有关胚胎干细胞及干细胞疗法得到了普遍重视 ,其中 ,造血干细胞被成功应用于临床疾病治疗。在对干细胞的研究和利用中取得了实质性突破的同时 ,也暴露出一些有关道德和伦理方面的社会问题。但是 ,随着对干细胞研究的深入 ,对干细胞的利用已展现出广阔的前景和产业化的可能。     

异荭草素抗肿瘤药理作用及其机制的研究

异荭草素是从植物中提取的含有黄酮类活性成分的化合物。研究表明,异荭草素具有多种药理作用,不仅可以抗氧化、抗炎、抗病毒,还具有良好的抗肿瘤活性。异荭草素可通过干扰肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、调控活性氧水平、诱导肿瘤细胞自噬、阻碍肿瘤细胞浸润和转移等途径发挥抗肿瘤作用。现将异荭草素的抗肿瘤作用及其机制的相关研究进展进行综述。     

野牦牛成纤维细胞的分离培养与传代

为了提高野牦牛成纤维细胞分离培养效果,研究了组织保存方法、原代培养方法、培养液类型、添加细胞生长因子和冷冻保存液配方对野牦牛体细胞分离培养与传代的作用。结果表明,PBS、D/F12和TCM199适合野牦牛皮肤组织的保存,D/F12和TCM199培养液适合组织块培养,组织块成活率达到（86.29±4.62）%,组织块法适合野牦牛成纤维细胞的原代培养;D/F12培养液培养野牦牛成纤维细胞效果较好,群体倍增时间和平台期密度分别为38.47 h和2.075×10⁶/mL,正常二倍体核型百分率为84.33%;表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞因子（bFGF）产生了较明显的促增殖作用,平台期细胞密度明显增加;2种冷冻保存液（D/F12添加胎牛血清和二甲亚砜及胎牛血清添加二甲亚砜）均能用于野牦牛细胞冷冻,细胞存活率分别是87.33%和89.00%。     

奶牛子宫内膜细胞体外培养及应用研究概况

子宫内膜细胞体外培养技术在研究动物子宫内膜生理功能、繁殖障碍疾病机制及治疗药物筛选等过程中具有重要的作用和意义。论文就国内外有关奶牛子宫内膜细胞体外培养技术中常用的分离、纯化和鉴定等方法以及该细胞体外模型相关应用进行综述,为探索简便、高效的奶牛子宫内膜细胞体外培养方法及国内有关奶牛子宫内膜生理病理的分子细胞学研究提供参考。     

牛胚胎生殖细胞的分离与培养

以牛胎儿为材料,从原始生殖细胞（PGC）分离培养出胚胎生殖细胞（EG）,并进行传代和鉴定,对影响胚胎生殖细胞分离与培养的因素进行了探讨,研究发现以共培养方式培养牛原始生殖细胞时,原代培养都可以出现大量形态较好的EG细胞集落,说明同源的体细胞可以很好地支持PGC的生长和增殖,组织块培养细胞克隆数目较少,PGC很难增殖,不能形成典型的集落,传代也不理想,只传了一代.同时比较了不同传代方法对牛胚胎生殖细胞细胞传代的影响,发现消化＋机械分离法和消化＋吹打法都可以用于EG细胞的传代.消化＋吹打法操作简单,省时省力,也能够很好的保持细胞的增殖活力.原代培养的牛原代胚胎生殖细胞进行了细胞表面标志抗原SSEA-1,3,4鉴定,呈弱阳性.细胞体外培养可以分化为成纤维样细胞、上皮样细胞和类胚体.     

悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析

采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析,比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示,与转瓶培养工艺相比,反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高,生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺,适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。     

山羊类ES细胞的分离与培养

旨在优化并建立有利于山羊类ES细胞生长的饲养层细胞、培养基、细胞因子和传代方法。本研究选择武汉市本地白山羊配种6～7 d后的胚胎,通过全胚培养法、酶消化与机械分离结合法分离山羊类ES细胞,并在不同的细胞饲养层中饲养、在培养基中添加不同的生长因子、采用不同的传代方法,比较不同培养条件对山羊类ES细胞生长和增殖的影响。通过碱性磷酸酶染色和免疫组化染色法鉴定ES细胞特异生物标记AKT、SSEA-1和Oct-4的表达,并将得到的山羊类ES细胞进行体外分化。结果表明,与小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibro-blast,MEF)和山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)相比,C2C12更有利于细胞的贴壁,但差异不显著(P>0.05);细胞传代时,在高浓度细胞因子LIF(Leukemia inhibitory factor)和SCF(Stemcell factor)中处理ICM(Inner cell mass),更有利于细胞传代(传至第8代);培养基中添加LIF和SCF的同时,添加肝素和胰岛素,更有利于细胞的传代(传至第9代);山羊类ES细胞中SSEA-1(...     

B细胞亚群与牛白血病发生的关系

对8头流行性白血病病牛,用8种单克隆杭体（McAb）,经过免疫组织化学ABC法和免疫荧光流式细胞检测法,观察了其免疫病理组织变化和外周血及肿瘤组织的B细胞亚群变化。结果7例病牛的BoCD5、BoCD11b和sIgM为阳性反应,表明肿瘤细胞来源于B1a细胞;1例病牛的BoCD11b和sIgM呈阳性反应,而BoCD5则呈阴性反应,说明该肿瘤细胞来源于B1b细胞。另外,在免疫组织化学染色肿瘤组织切片上在浸润的淋巴细胞中不仅见有较多的CD3和CD5阳性细胞,而且也见有较多的CD3和CD5阳性肿瘤细胞。表明流行性牛白血病的肿瘤细胞主要来源于Bla细胞,其他类型的淋巴细胞也有可能突变为白血病的肿瘤细胞。     

猪子宫大豆素(SBA)受体细胞和肥大细胞观察

本研究用HRP—SBA标记技术、甲苯胺染色法及甲苯胺蓝和HRP—SBA双重染色技术,观察了猪子宫大豆素(SBA)受体细胞和肥大细胞.发现SBA受体细胞和肥大细胞,形态相似,但两者在子宫壁内的分布和数量不同.双重染色证明,SBA受体细胞和肥大细胞是存在猪子宫内膜的不同细胞.