三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立

血卵涡鞭虫病是近年来三疣梭子蟹养殖过程中发生的一种危害较大的流行性疾病,患病蟹的体液和肌肉组织中有大量的血卵涡鞭虫寄生.该病多发生于每年9～11月份的夏秋季节,会在短时间内出现死亡高峰.因该病流行范围广、死亡率高、危害严重,对三疣梭子蟹养殖业发展影响很大.本文根据GenBank中登陆的血卵涡鞭虫18S rDNA和ITS1基因序列设计了1对特异性引物,建立了血卵涡鞭虫病的PCR检测方法,从感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹组织DNA中扩增出产物大小为585 bp的DNA片段.本方法可快速、特异地检测出三疣梭子蟹感染和携带血卵涡鞭虫的状况,为三疣梭子蟹的健康养殖和血卵涡鞭虫病的流行病学调查提供了快速、简便的手段.     

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒（AIV）抗原的双抗体夹心ELISA方法。经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件：兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1：8000（浓度为3.531μg/ml）,抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1：800,酶标二抗的工作浓度为1：4000。与其他禽易感病毒（NDV、IBV、EDS-76V）等均没有交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳反应条件为:抗PEDV单克隆抗体E1包被质量浓度4.40μg·mL~(-1),37℃包被2h,采用5%BSA封闭液封闭1h,兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·mL~(-1),酶标二抗稀释度为1∶2000,以OD450nm≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·mL~(-1)(5×103.12);重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份,阳性样品符合率为92.30%,表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点,可用于PEDV快速检测。     

猪囊尾蚴头节蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

采用抗猪囊尾蚴头节蛋白单克隆抗体包被ELISA板,以兔抗猪囊尾蚴头节蛋白多抗作为捕获抗体,建立了猪囊尾蚴头节双抗体夹心ELISA检测方法,用该方法分别检测猪囊尾蚴、棘球蚴和猪蛔虫具有良好的特异性。用ELISA和RT-PCR同时检测120份样品,ELISA的特异性和敏感性分别为98.1%和80.0%,2种方法的符合率为95.8%。     

双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV

用蔗糖密度梯度离心法纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得2株分泌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体,建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA最佳反应条件为,兔抗PEDV抗体稀释度为1:800包被37℃1 h加4℃12 h,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:2 000作用45 min,以OD490nm≥0.37作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为5×103.67TCID50/m L,并与猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒无交叉反应。用该ELISA方法和RT-PCR方法检测48份临床粪便样品,结果显示,ELISA阳性检出率为39.6%,而RT-PCR方法检测卡的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测。     

犬瘟热病毒单抗夹心ELISA检测方法的建立

以2株犬瘟热病毒(CDV)特异性单克隆抗体2H11和1G7为基础建立了检测CDV的单抗夹心ELISA方法.用单抗2H11作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗1G7为检测抗体,通过方阵试验确定2H11和1G7-HRP的最佳工作浓度分别为200和475 ng· mL-1.建立的单抗夹心ELISA方法具有良好的...     

猪囊尾蚴头节蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

采用抗猪囊尾蚴头节蛋白单克隆抗体包被ELISA板,以兔抗猪囊尾蚴头节蛋白多抗作为捕获抗体,建立了猪囊尾蚴头节双抗体夹心ELISA检测方法,用该方法分别检测猪囊尾蚴、棘球蚴和猪蛔虫具有良好的特异性。用ELISA和RT-PCR同时检测120份样品,ELISA的特异性和敏感性分别为98.1％和80.0％,2种方法的符合率为95.8％。        

三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立

血卵涡鞭虫病是近年来三疣梭子蟹养殖过程中发生的一种危害较大的流行性疾病,患病蟹的体液和肌肉组织中有大量的血卵涡鞭虫寄生.该病多发生于每年9～11月份的夏秋季节,会在短时间内出现死亡高峰.因该病流行范围广、死亡率高、危害严重,对三疣梭子蟹养殖业发展影响很大.本文根据GenBank中登陆的血卵涡鞭虫18S rDNA和ITS1基因序列设计了1对特异性引物,建立了血卵涡鞭虫病的PCR检测方法,从感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹组织DNA中扩增出产物大小为585 bp的DNA片段.本方法可快速、特异地检测出三疣梭子蟹感染和携带血卵涡鞭虫的状况,为三疣梭子蟹的健康养殖和血卵涡鞭虫病的流行病学调查提供了快速、简便的手段.     

检测牛IL-4双抗体夹心ELISA方法的建立

为利用牛白细胞介素-4 (BoIL-4)的特异性单克隆抗体(MAb)建立检测BoIL-4的双抗体夹心ELISA方法,以多种ELISA方法对7株抗BoIL-4的单抗进一步筛选,得到反应最佳的2株单抗8B7和4A10,以A9表达的重组BoIL-4为阻断剂的阻断ELISA试验中,表明这2株单抗也可识别所构建的细胞系A9表达的重组BoIL-4。以单抗8B7作为包被抗体,以标记了HRP的单抗4A10作为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA方法可检测大肠埃希菌、毕赤酵母和Flp-In-293细胞系3种表达系统表达的重组BoIL-4,最低检测限分别为0.25、8和2 ng·mL^-1,且对A9细胞系上清中表达的BoIL-4检测效果和特异性良好。该研究建立的BoIL-4双抗体夹心ELISA方法为深入研究BoIL-4、开发BoIL-4 ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体(monoclonal antibody,mAbs)为基础,建立检测膦丝菌素乙酰转移酶(the phosphinothricin acetyltransferase,PAT)的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因(blalaphos resistance gene)bar,并与表达载体pET28a构建重组质粒,诱导表达产生外源性PAT蛋白;以纯化后的PAT蛋白为免疫原,制备mAbs,建立双抗体夹心ELISA方法,并与PCR检测方法进行比较,确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法,其有效检测范围为3.125~50ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测,根据阴阳性判定值OD450>0.210,检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份,以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份,2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法,可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

兔支气管败血波氏杆菌双夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性好、敏感性高、稳定可靠的兔支气管败血波氏杆菌(Bb)双夹心ELISA检测方法,制备了兔抗Bb免疫血清和小鼠抗Bb腹水单抗(Bb McAb),并将它们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感性试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并与PCR检测方法比较。结果表明,兔抗Bb IgG的最佳稀释度为1∶6 400,浓度为2.5 mg/L;单抗的最佳稀释度为1∶800,浓度为5.0 mg/L。特异性试验和重复性试验结果表明,该方法特异性强、重复性好,与兔常见病菌大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌和产气荚膜梭菌均不发生反应,同时与PCR检测方法的符合率为100%。     

甜瓜枯萎病菌ELISA检测方法的初步建立

采用甜瓜枯萎病病菌菌丝蛋白作为抗原,制备该病菌菌丝蛋白的多克隆抗体,建立检测甜瓜枯萎病菌的间接ELISA检测方法。利用检测技术对田间病样和土壤中的病原菌含量进行了定性、定量检测,表现出方便、特异性强、灵敏度高的特点。可运用此方法对甜瓜枯萎病进行田间检测。     

牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的牛轮状病毒(BRV)分别免疫鼠和兔,制备了鼠抗BRV和兔抗BRV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测BRV的双抗体夹心ELISA方法.该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:兔抗BRV IgG包被浓度为10μg·mL-1,鼠抗BRV IgG工作浓度为5 μg·mL-1,样品反应时间60 mi...     

黄海希瓦氏菌单抗介导间接ELISA快速检测技术的建立

应用农业部海洋水产增养殖学重点实验室制备的特异性抗黄海希瓦氏菌Shewanella smarisflavi AP629单克隆抗体3D9作为一抗,以碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠Ig作为酶标二抗,建立了仿刺参Apostichopusjaponicus＂化皮病＂病原菌——黄海希瓦氏菌AP629的间接ELISA快速检测方法,并进行了条件优化。结果表明：抗原的最佳包被浓度为107个/mL,一抗工作的最佳稀释度为1∶32,病原菌的检测灵敏度为5×105个/mL。该方法特异性强,与希瓦氏菌属其它种类、弧菌和气单胞菌等均无交叉反应。该方法的建立有助于快速准确地诊断由黄海希瓦氏菌AP629引起的仿刺参疾病。     

温氏附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用辛酸硫酸铵法从温氏附红细胞体高免血清中提取IgG,过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶,建立了检测温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA.结果显示:抗体最佳包被量为156μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为6.64μg/mL,抗原及酶标抗体的最佳作用时间分别为1 h.应用建立的检测方法对河北省内222份奶牛血样进行了检测,阳性检出率为91.0%.证实:该方法灵敏度高,简便快速,适合作群体检测.     

草鱼点状产气单胞菌单克隆抗体的制备与双抗原夹心ELISA法的建立

为了建立一种快速、准确能早期检测草鱼肠炎病原菌的方法,以患病草鱼为材料,制备点状产气单胞菌单克隆抗体(McAb),并鉴定其特异性和抗原表位;采用过碘酸钠方法,以辣根过氧化物酶标记单抗,用试管凝集试验测定其活性;建立点状产气单胞菌McAb的双抗原夹心ELISA检测方法,确定包被单抗和酶标单抗的浓度,并测定其灵敏度和特异性。结果:1)获得了2株特异性强和抗原表位不同的单抗,其ELISA效价为1∶16 000。2)辣根过氧化物酶标记的抗体活性为1∶640。3)建立了包被抗体稀释度为1∶800、酶标抗体稀释度为1∶1 600的双抗原夹心ELISA检测方法,该方法与点状产气单胞菌呈强阳性反应,与近似菌无交叉反应,灵敏性为7×103cfu/mL。结论:制备的点状产气单胞菌McAb的效价高、特异性强;建立的双抗原夹心ELISA方法操作简单、灵敏度高、特异性强,可应用于草鱼肠炎病原体的早期快速检测。