高效解磷菌Bacillus subtilis P-1的N离子束诱变育种

通过N离子束注入对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis P-1进行诱变,筛选得到一株解磷能力提高48 %的突变菌株B.subtilis P-1-5.对B.subtilis P-1和B.subtilis P-1-5发酵过程中碱性磷酸酶活性(AKP)和可溶性磷含量进行了定量分析,结果表明两者的碱性磷酸酶活性和可溶性磷含量变化趋势基本一致,但B.subtilis P-1-5均比同期B.subtilis P-1值高,说明突变菌株B.subtilis P-1-5比原始菌株B.subtilis P-1解磷性状优良.     

基于16S rDNA序列4株鸡源芽孢杆菌的分子鉴定

对分离自肉鸡肠胃的4株芽孢杆菌R1、R2、S1、H1的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在NCBI中通过Nucleotide BLAST查找其同源序列,应用DNAstar的MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V 、Clustal W3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega5.0软件中的最大似然法、邻接法、最小进化法、最大简约法构建系统发育树.序列差异和同源性分析结果显示:由Jotun Hein法可知,H1和R2与Bacillus subtilis DSM10同源性最高,达到100％;R1与B.vallismortis DSM11031同源性最高,达到99.7％;H1与B.subtilis DSM10的同源性为99.9％.由Clustal V法可知,H1与R2同源性最高,达到99.6％;R1与S1同源性最高、为98.7％.由Clustal W法可知,H1与R2同源性最高、为99.7％,R1与S1为99.4％.采用4种方法构建的系统发育树基本一致,可以确立4株鸡源芽孢杆菌的分类地位,R1、S1与B.subtilis BPRIST009、B.subtilis LXB3、B.vallismortis DSM11031之间关系最为亲近;R2、H1与B.subtilis CICC10076、B.subtilis DSM10之间关系最为亲近.     

Bacillus subtilis fmbj与2-脱氧葡萄糖协同作用Rhizopus stolonifer的生物防治效果

 【目的】通过添加佐剂2-脱氧葡萄糖（2-DOG）的方法提高拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis fmbj)菌株的生防效果。【方法】分别在PDA平板和水蜜桃上测定2-DOG对拮抗菌B.subtilis fmbj和病原菌桃软腐病菌葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)生长的影响及B.subtilis fmbj与不同浓度2-DOG协同作用对R.stolonifer的防治效果。【结果】平板试验表明,2-DOG浓度仅为0.3 mg•mL-1时,可完全抑制R.stolonifer的生长;而2-DOG高达20 mg•mL-1,B.subtilis fmbj依然存活,表现出对2-DOG有较高的耐受性。桃上接种试验发现,单独使用浓度为3.9×108 CFU/mL B.subtilis fmbj时,桃果实发病率为30%;4 mg•mL-1 2-DOG单独使用时桃果实发病率为35%;而当4 mg•mL-1 2-DOG和3.9×107 CFU/mL B.subtilis fmbj配合使用时,可完全抑制果实的腐败。【结论】拮抗菌B.subtilis fmbj和2-DOG协同作用比单独使用对桃果实软腐病的防治效果明显,该研究结果为桃果实采后病害控制和保藏提供了有效的方法与途径。     

高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢杆菌的筛选及glsA基因的克隆

为筛选获得高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢杆菌菌株,提高谷氨酸的含量,试验通过康维皿弥散法对525株芽孢杆菌进行酶活检测,获得一株产谷氨酰胺酶活力为68.407 mg NH3/(g曲·h·37℃)的B.subtilis GA317菌株,其酶活力较B.subtilis BJ3-2高5.59倍.对2个菌株谷氨酰胺酶编码基因glsA...     

向日葵黄萎病拮抗细菌Y1-2菌株的鉴定与抑制效果

从向日葵黄萎病病区的健康植株根际分离到l株对向日葵黄萎病病原菌(Verticillium dahliae Kleb.)具有较强拮抗作用的菌株Y1-2.经形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列对比分析结果表明,菌株Y1-2鉴定为Bacillus subtilis,其与(CJT14XVY01S)B.subtilis序...     

大麦赤霉病菌拮抗细菌CC41的鉴定

通过培养性状观察与分子标记试验,对一株大麦赤霉病菌拮抗细菌CC41进行了鉴定,结果表明:CC41的形态及部分生理生化特征与Bacillus subtilis极为相似; 两者的16S rDNA序列具有99.2%的同源性;在系统发育树上构成一个分支.由此确定该拮抗细菌属于枯草芽孢杆菌B.subtilis的一个菌株.     

一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌NWMCC0137全基因组测序及分析

NWMCC0137是从屠宰场下水道污泥中分离获得的1株高效分解血液蛋白并具有良好生物防控特性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。为探究枯草芽孢杆菌NWMCC0137(B.subtilis NWMCC0137)高效水解血液蛋白机制及挖掘次级代谢产物编码基因资源，利用DNBSEQ与PacBio测序平台对其进行全基因组测序并进行序列组装和基因预测、功能注释、比较基因组分析。结果表明B.subtilis NWMCC0137的基因组长度为4 215 585 bp, G+C含量为44.23%;编码基因总长度为3 711 885 bp,编码4 384个基因，编码序列占整个基因组长度的88.05%,非编码RNA中包含85个tRNA基因。在KEGG数据库中B.subtilis NWMCC0137基因组被注释到7种胞外蛋白酶编码基因，其中与丝氨酸蛋白酶相关的编码基因有8个。通过antiSMASH预测发现，菌株NWMCC0137基因组中包含7种与已知次生代谢产物合成基因簇相似度为100%的基因簇，包括产孢致死因子、聚酮类化合物、丰原素、枯草芽孢杆菌素168、儿茶酚型嗜铁素、芽孢杆菌素、杆菌...     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

黄瓜白粉病生防菌H_1、H_2的种类鉴定

通过形态特征、培养条件及生理生化指标,结合16SrDNA分子序列测定,对黄瓜白粉病生防菌H1、H2进行了鉴定.结果表明:生防菌H1、H2的形态特征及22项生理生化指标与枯草芽孢杆菌相符;生防菌H1、H216SrDNA序列与Genbank数据库中枯草芽孢杆菌的相似性高于99.5%,因此,H1、H2均为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp.ubtilis).综合上述结果,最终确定生防菌H1、H2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

一株产木聚糖酶菌株的筛选及产酶条件优化

以木聚糖为唯一碳源,采用刚果红平板显色法从土壤中筛选出一株产木聚糖酶活性较高的菌株,经形态学和16S rDNA序列分析确定其为芽孢杆菌属,命名为Bacillus subtilis. YH169。通过单因素和正交试验优化了培养基配方和发酵条件,结果表明:最佳培养基配方为麸皮5.0%、氯化铵0.3%、Mg2+浓度0.03%,初始pH值为5.0,在37℃条件下培养72 h,Bacillus subtilis.YH169产木聚糖酶活性较高,达24.40 IU/mL。     

来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究

漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶,在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂白等工业中有重要的应用价值。从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆漆酶cotA基因,全长1 542 bp,编码513个氨基酸,外加一个终止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta（DE3）菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化,获得的重组酶蛋白CotA的最适反应温度为60℃,最适pH为4.5。该酶在60℃具有较好的热稳定性,保温90 min后仍有71.70%的剩余酶活。最适反应条件下,重组酶对ABTS的Km为63.9±5 μmol/L,kcat为39.1±1/s,最大反应速率为0.005 μmol/L·min·mg,且在最适反应条件下,微好氧发酵法获得的重组酶蛋白CotA的比活（557.8 U/mg）是低温诱导法（0.2 U/mg）的2 655.4倍。因此,通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶CotA的比活力。     

生防菌株HJX1的鉴定和抑菌谱的测定

依据传统形态学、16S rRNA基因序列及脂肪酸图谱鉴定,将一株对香蕉镰刀枯萎病菌有很好抑制效果的菌株HJX1鉴定为枯草芽孢杆菌。采用细菌的通用引物P0和P6扩增16S rRNA基因片段,得到1521bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌的序列的同源性高达99%;细胞组分脂肪酸的含量同枯草芽孢杆菌最近,其相似度为0.724。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株能对供试的10个植物病原真菌均有很好的抑制作用。     

纳豆芽胞杆菌KX株纳豆激酶基因的克隆及序列分析

设计引物进行PCR反应,从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增和克隆纳豆激酶基因.序列分析表明,所克隆的纳豆激酶基因序列全长1 473 bp,其中阅读框架1 143 bp,阅读框架以GTG为起始密码子,编码包括信号肽、前导肽、成熟肽在内的381个氨基酸;表达产物为前纳豆激酶原,其中N端29个氨基酸组成信号肽,随后的77个氨基酸组成前导肽,最后的275个氨基酸组成成熟肽.     

生防菌株XF-1的鉴定和抑菌谱的测定

 依据传统形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列,将一株对十字花科根肿病有很好防治效果的菌株XF-1鉴定为枯草芽孢杆菌。采用细菌的通用引物P0, P6扩增16SrRNA基因片段,得到1513 bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌的序列的同源性高达99%。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株能对供试的卵菌、子囊菌、担子菌和半知菌的21个植物病原真菌均有很好的抑制作用。     

一株产聚谷氨酸芽孢杆菌的分离与鉴定

从超高压灭菌的瓜汁中筛选出 1株产高分子聚合物的芽孢杆菌B53 。经紫外扫描、高效液相色谱分析及SDS PAGE分子量表征 ,确定该高分子是由谷氨酸单一成分组成的聚合物 ,最大吸收波长为 2 12nm ,分子质量集中在 5 70～ 6 6 9ku ,呈多分子质量聚集体形式 ,不具备典型肽或蛋白质特征。依据B53 的菌株形态、生理生化特征、G +C含量 (摩尔分数 )及 16SrRNA基因序列分析结果 ,将芽孢杆菌B53 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定

[目的]鉴定1株高产甘露聚糖酶菌株。[方法]以高产甘露聚糖酶的菌株为对象,采用形态观察、生理生化试验及16S rDNA系统发育分析手段对其进行鉴定。[结果]该菌株在牛肉膏蛋白培养基上培养24h后,菌落表面粗糙,不透明白色,革兰氏阳性,杆状,能形成芽孢,表明其属于芽孢杆菌属。对F1-5进行生理生化特征鉴定,结果表明,其为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。PCR扩增获取该菌的16S rDNA基因。经BLAST同源序列比对,结果显示,菌株F1-516SrDNA与枯草芽孢杆菌的16S rDNA具有99％的同源性,表明F1-5为枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为甘露聚糖酶工业化开发应用奠定了基础。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B2116SrDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B.subtilis16SrDNA序列(登陆号AY172513)有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的一个菌株。     

枯草芽孢杆菌B-FS01鞭毛蛋白FCD基因克隆与拮抗活性

以从油菜菌核病菌感染的油菜茎秆上分离得到的广谱性拮抗菌枯草芽孢杆菌为研究对象,克隆了该菌B-FS01鞭毛蛋白FCD基因片段,其序列长为952 bp (GenBank登录号为EF362756).根据FCD序列同源性分析, B-FS01属于以DB9011菌株为代表的亚组,而该亚组菌株普遍具有抗真菌活性.平板抑菌活性试验表明, B-FS01对小麦赤霉病菌具有较好的拮抗活性,高分辨率质谱分析发现其可能产生一些脂肽类抗菌物质.     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

PhoR/PhoP双因子调控系统在枯草芽孢杆菌NCD-2菌株解磷能力中的功能分析

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2能有效的防治棉花黄萎病,同时还具有降解蛋黄卵磷脂的能力。将含有mini Tn10转座子的pHV1249质粒电击转入NCD-2菌株中,51℃高温诱导转座子插入突变,构建了NCD-2菌株的解磷突变子库,筛选到3株丧失解磷能力的突变子。运用染色体步移技术对突变株M216中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和序列分析,结果表明丧失解磷能力突变株中转座子插入基因与B.subtilis 168菌株中PhoR基因的相似率达到98%,Southern杂交验证突变株中转座子为单拷贝插入。将PhoR基因克隆到pHY300PLK质粒上构建重组质粒电击转化M216进行功能互补验证,互补菌株部分恢复了解磷能力,表明NCD 2菌株中PhoR基因与其降解卵磷脂能力具有相关性。