加入自我延伸过程的融合PCR程序

比较了加入自我延伸过程的融合PCR程序与传统PCR在扩增融合基因的扩增效果,自我延伸程序(94 ℃×1min,52℃×1 min,72℃×1 min)扩增2次,分别用不同的延伸时间:1 min、2 min、3 min、5 min,发现用2 min、3 min、5 min延伸时间扩增出的融合基因条带比传统PCR显著亮一些,而用延伸时间为1 min时,两种程序扩增出融合基因条带的亮度相近,说明自我延伸程序中的延伸时间是影响融合基因扩增量的关键因素.加入自我延伸过程的融合PCR扩增程序为:94 ℃×5 min,(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×5 min)×2次循环,(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×1 min)×30次,4℃ store.     

K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序

利用重叠延伸PCR技术将K88ac STⅡ融合基因克隆于T载体上,将重组基因质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,通过PCR、NcoI/XcoI酶切后测序,与genbank报道的K88ac结构基因序列进行比对,证明所克隆的目的片段为K88ac STII融合基因。     

融合基因构建方法的建立

重叠PCR技术是以聚合酶链式反应为基础,将多条DNA片段进行融合;PCR-酶切连接主要应用于基因片段连接及载体构建,这两种方法在基因工程与分子生物学领域已得到广泛应用。以多毛番茄抗冷转录因子LhCBF1基因、EGFP基因及RD29A启动子为例,分别采用一步法重叠PCR、二步法重叠PCR及PCR-酶切连接技术,优化PCR体系及反应条件,成功构建LhCBF1-EGFP及RD29A::EGFP融合基因。研究为重叠PCR及PCR-酶切连接技术的改进及构建融合基因方法的选择提供了有益参考。     

重叠PCR一步法对三种淀粉合成酶融合基因的构建

采用重叠PCR一步法对马铃薯块茎3种淀粉合成关键酶gbss、ssⅢ和ssⅡ的基因片段进行融合.结果表明:该方法在PCR反应体系中通过6个引物3个模板扩增得到1个含有马铃薯块茎3种淀粉合成关键酶gbss、ssⅢ和ssⅡ基因片段的融合基因gs3s2;与经典的重叠PCR方法相比,该方法不需对PCR产物进行回收,而只需一个PCR反应就可以构建得到融合基因,是一种快速、方便有效的构建融合基因的方法.     

番木瓜环斑病毒融合基因植物表达载体的构建

利用PCR重叠延伸技术（gene splicing by overlap extension,SOE）将番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）Vb株系的外壳蛋白（coat protein,CP）基因和Ys株系的复制酶（replicase protein,RP）基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Pyrobest DNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因n’构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜奠定基础。     

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。     

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究(英文)

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。     

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。     

利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23基因

分析已知柑桔衰退病强毒系基因组并克隆CTV中一个重要的基因P23.利用重叠延伸PcR法的原理,成功的将P23基因保守序列第206位碱基由C突变成T,由此该位点成为限制性酶(SacI)的识别位点.把改良后的P23基因插入到T载体中,测序发现成功地突变掉目的位点.为进一步利用分子生物学手段研究CTV病毒,克隆突变CTV序列奠定了基础.     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

木聚糖酶处理对麦秸纤维板尺寸稳定性的影响

对经木聚糖酶处理和未处理麦秸纤维制成的纤维板的尺寸稳定性进行了研究.在不同温度(20、30、40℃)和不同相对湿度(10％、30％、50％、70％、90％)条件下,研究了木聚糖酶处理对麦秸纤维板的长度方向、宽度方向和厚度方向上尺寸增长率的影响.结果表明:在相同环境温度和相对湿度条件下,酶处理麦秸纤维板在3个方向上的尺寸稳定性均优于未处理麦秸纤维板,其中酶处理的麦秸纤维板的长度增长率在0.032％～0.355％、未处理麦秸纤维板的长度增长率在0.097％～0.422％;酶处理的麦秸纤维板的宽度增长率在0.033％～0.331％、未处理麦秸纤维板的宽度增长率在0.066％ ～0.400％;酶处理的麦秸纤维板的厚度增长率在2.962％～21.513％、未处理麦秸纤维板的厚度增长率在3.936％～23.058％.温度和湿度对麦秸纤维板的尺寸稳定性有较大影响,在一定的温湿度范围内,温度愈高,湿度愈大,尺寸稳定性越差.     

融合及培养条件对甘蓝和萝卜原生质体融合及细胞分裂的影响

探讨了融合液、原生质体密度及不同品种对原生质体融合效果的影响。在融合液中加入0.5mol/L甘露醇和1mmol/LCaCl·22H2O可以有效提高融合率。1×105/mL的原生质体密度可以得到较高的二体融合率。不同品种对融合率影响不大,但对细胞分裂率有较大影响。     

产木聚糖酶菌株的分离及木聚糖酶的固定化

从草鱼肠道中分离筛选出6株产木聚糖酶的菌株,从中挑选产酶量最大的菌株测定酶液活力,并采用壳聚糖、海藻酸钠等固定游离酶.结果表明,与游离酶相比,壳聚糖固定酶的最适pH向碱性方向偏移,海藻酸钠固定酶的最适pH向酸性方向偏移.与游离酶相比,固定化酶有较高的最适温度和较强的热稳定性.     

木聚糖酶的稳定性研究

 研究了GXC木聚糖酶的稳定性。结果发现:木聚糖酶具有较好的热稳定性和pH 稳定性,对金属离子不敏感,耐储存,对胰蛋白酶的耐受性大于胃蛋白酶。     

一株产木聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

从土壤中筛选出一株高产木聚糖酶的菌株ZK2,结合形态学以及16S rDNA序列同源性分析对菌株进行鉴定,并对菌株的产酶条件进行优化。结果表明,菌株与枯草芽孢杆菌的相似度最高,在温度38℃、初始pH 8.0、发酵时间54 h、接种量10%时,菌株的产酶条件最优。     

木材干燥过程中含水率空间分布融合方法的研究

选取杨木作为试材,有效避免了以往木材干燥过程中出现的木材含水率检测点数量有限,不能连续全面地描述木材含水率分布状态的问题,使用选择离散点数据的方法,再应用粒子群算法优化支持向量机算法、支持向量机预测算法、最小二乘法非线性拟合方法以及进行空间数据预测来比较算法预测能力,然后把木材干燥过程中的材堆模型模拟成长方体并建立空间模型,应用PSO优化的SVM算法对X坐标轴建立函数模型进行验证。通过数据分析比较可得:基于PSO优化SVM算法在针对同一试材上空间离散木材含水率采集数据进行空间数据预测仿真出的连续含水率曲线误差最小,仿真曲线逼近真实含水率分布曲线。     

pH对木聚糖酶活性的影响

采用DNS法考察了pH对木聚糖酶活力变化的影响,结果表明,该酶的最适反应pH为6.0,在37,40,50℃下保温30,60min后酶在pH5￣10之间可保持较高的活性,不同保温时间对酶活性没有影响。50℃时的pH对酶的活性影响最小,其次是37,40℃。     

木聚糖酶的超滤纯化方法研究

[目的]寻求更高效、经济的木聚糖酶超滤方法。[方法]选用2种不同的超滤方法对木聚糖酶进行超滤,并将超滤结果进行比较。[结果]超滤过程中添加缓冲液的方法更为经济有效,超滤后分子量在30～50kDa和10～30kDa的酶液比活力较高,分别被纯化了3.55和8.41倍,蛋白质损失量较小。[结论]木聚糖酶超滤过程中添加缓冲液的方法更具有生产低聚木糖的经济价值。     

嗜热木聚糖酶酶学性质研究

[目的]研究嗜热木聚糖酶的酶学性质.[方法]考察了基因工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64所产嗜热木聚糖酶反应的最适温度、最适pH,嗜热木聚糖酶的热稳定性、pH稳定性,以及不同金属离子对酶活力的影响.[结果]嗜热木聚糖酶的最适反应温度为110℃左右,最适pH为6.6,具有较广的pH稳定范围和非常好的热稳定性,高浓度的Mn2+、Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,Cu2+、Zn2+以及低浓度的Mn2+对该酶有抑制作用.[结论]研究可为嗜热木聚糖酶的广泛应用提供参考依据.     

城市化过程对土地利用格局的影响

以东营市为例,分析了城市化过程对土地利用格局的影响.结果表明:东营市的城市化水平呈逐渐增加的趋势;土地利用格局主要以耕地的减少、居民地和园地的增加为主要特点.关联分析表明,城市化水平与耕地、园地、居民地、水域的关联程度极显著(0.01水平),并呈线性回归关系.同时进一步提出了东营市土地利用的可持续发展对策.