板栗短雄花序芽变与母树的形态和营养差别研究

以短雄花序板栗为试材,比较板栗短雄花序芽变与对照的形态特征和营养.结果表明:雄花序显著短于对照,平均长2.2 cm,对照为14 cm;芽变的叶片较大,营养枝和结果枝生长势都强于对照,芽变叶片和雄花序在糖类物质,蛋白质及叶绿素含量上都显著高于对照,而芽变坚果果实含糖量低于对照.     

应用抑制性消减杂交分离板栗短雄花序芽变相关基因

利用抑制性消减杂交技术分离了板栗正常花序与芽变花序之间表达的差异cDNA片段。以芽变板栗雄花序cDNA为试验方(tester),以对照板栗雄花序cDNA为驱动方(driver),构建了一个板栗芽变花序消减文库。菌落PCR显示插入片段主要在100～1000 bp,文库质量良好。通过对文库阳性克隆随机测序共得到了30个有效EST序列。利用Blast同源性比较,其中一些EST可能与板栗雄花序发育中变短的生物学形态形成密切相关,为后续板栗短雄花序芽变相关基因的研究奠定了基础。     

板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及CmGID1基因的表达分析

 利用赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯利和吲哚乙酸分别涂抹板栗短雄花序,结果显示仅赤霉素能够抑制短雄花序顶端的细胞程序性死亡,并在一定程度上恢复短雄花序的伸长生长。通过RT-PCR扩增方法,从板栗短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中克隆出赤霉素受体基因GID1部分序列。测序及序列分析结果表明：克隆的cDNA片段为786 bp,所推导的氨基酸序列与杨毛果GID1氨基酸序列有91%的同源性,与陆地棉、蓖麻GID1均有85%的氨基酸序列同源性。经氨基酸序列功能分析,推测该GID1序列是板栗有编码功能的赤霉素受体基因,命名为CmGID1（GenBank登录号为HQ651231）。实时荧光定量PCR结果显示,从花序萌发至花药萌发前期,除其中一个时期（5月23日）外,芽变短雄花序CmGID1的表达量均高于正常雄花序;在花序的快速生长期,芽变短雄花序CmGID1表达量显著高于正常雄花序（P < 0.01）;且赤霉素处理后恢复生长的短雄花序CmGID1表达量显著降低（P < 0.01）。综合试验结果,初步揭示了该短雄花序为一个赤霉素缺陷型突变体。     

板栗CmMYB转录因子基因的克隆及在花序发育中的表达分析

板栗大量雄花序影响产量形成,寡雄性状是板栗重要的育种目标。利用RT-PCR与RACE扩增方法,从板栗极短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中分离出一个板栗MYB转录因子cDNA全长,进行测序和序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段总长为1 522 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1 071 bp,可编码长度为357个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与苹果的MYB91、豌豆的MYB转录因子和蒺藜苜蓿的MYB转录因子基因分别具有88%、87%和87%的氨基酸序列同源性。序列分析及空间结构预测发现该序列具有完整的R2R3区域,推测其具有转录激活功能。命名为CmMYB(GenBank登录号为GU076490)。实时荧光定量PCR结果显示,芽变雄花序CmMYB转录因子在雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、雄蕊原基形成期和花药形成期的表达量均低于正常雄花序中的表达量,而在花被原基形成期表达量高于正常雄花序中表达量,说明该转录因子调控的主要基因与雄花序的短化存在一定联系。     

栗芽发育特性的研究

通过对栗芽的观察研究,明确了栗树新梢上的叶、芽、花序均在芽内奠基;雄花序主要在芽形成的当年的6—8月分化;混合花序在冬季休眠后至萌芽前分化,混合花序是由冬前雏梢分化期分化的雏梢叶腋间的芽原基发育而成;混合花序的分化是芽已经在上年分化有雄花序的基础上进行的;不同的修剪方法对花芽的分化有不同的作用,休眠期对弱枝疏剪,有促进完全混合芽形成的作用;对外围延长枝的短截及完全混合芽的形成有不利的影响;栗的许多生长结果特性均受芽发育特性的影响。     

新疆早实核桃花芽分化特性研究

以新疆主栽早实核桃品种'新新2'为试材,制作花芽石蜡切片,观察花芽形态分化进程。结果表明:早实核桃品种'新新2'雌花芽分化分为5个时期,即雌花芽形态分化初期、雌花原基分化期、苞片原基分化期、花被原基分化期、雌蕊原基分化期;雄花芽分化分为5个时期,即雄花序分化期、雄花原基分化期、萼片原基分化期、雄蕊原基分化期、花药分化期,但雄花芽分化5个阶段明显短于雌花芽分化;雌花芽完成整个分化过程需历经1年左右的时间,各时期分化时间长短不同,雌蕊原基分化期最短,只需3周左右,花被原基分化期最长,需历经33周左右跨年才能完成;雄花芽分化各阶段时间较短,一般1~4周即可完成,但花药分化需至次年3月下旬完成;雌、雄花芽相邻各分化阶段都有交叉重叠现象,雌花芽分化重叠期最短1周,最长7周左右,雄花芽分化重叠期较雌花芽短,都在1周左右。     

雄花败育板栗形态特征调查与分析

通过对雄花败育板栗的外部性状进行调查,与可育品种(系)‘燕龙’和‘燕胜’对比发现,雄花败育板栗新梢长度极显著短于可育品种(系),叶片显著大于可育品种,雄花序长度极显著短于可育品种(系),并且早期脱落。     

小菊花色芽变品系的SRAP鉴定

利用SRAP技术进行小菊粉色花芽变与黄色花对照的DNA多态性分析。88对引物共扩增出清晰条带1169条,分子量在147～700bp之间。芽变品种及对照遗传相似系数为0.997,遗传物质多态性为0.68%,表明芽变与对照在遗传背景上高度的一致。筛选出5对引物,获得8条可能与花色芽变基因有关的特异条带,粉色花特有条带为190、550bp(Me4-Em10)、560bp(Me5-Em1)、410bp(Me6-Em7),对照特有条带为570、557bp(Me4-Em11)及220、350bp(Me6-Em5)。这些特异条带能够在植物生长早期鉴别芽变品种与对照。推测造成小菊粉色花芽变的原因很可能是染色体结构的变异。     

沙田柚芽变品种“真龙柚”的分子标记鉴定

真龙柚是从沙田柚芽变中选育出的新品种。为了进一步确定芽变系性状的可遗传性,对沙田柚和真龙柚及其无性系子代6个样品进行了RAPD和SSR分析。结果表明,8个RAPD引物共扩增出43条稳定清晰的条带,其中5条具有多态性,多态性比率为11.6%;26对SSR引物共扩增出34条带,只有5条带具有多态性,多态性比率为14.7%;真龙柚样品与沙田柚样品的遗传距离为0.063,它们之间在DNA水平上存在遗传差异。     

川中岛桃芽变系的SRAP分析

为从分子水平上区分"川中岛"桃Prunus persica‘Kawanakajima’及其芽变,以川中岛桃及其芽变为材料,在分析其表型特征和观察物候期的基础上,采用SRAP分子标记技术,对其遗传稳定性进行了研究。结果表明,川中岛及其芽变的主要表型差异表现在成熟期提前等方面;选择25对引物进行PCR扩增,仅在2对引物中检测到3条多态性片段,说明川中岛及其芽变遗传物质没有发生较大变异,本研究中所得到的多态性片段可能与物候期的结构基因有关,或者与这些基因的表达调控有关。     

Short catkin1, a novel mutant of Castanea mollissima, is associated with programmed cell death during chestnut staminate flower differentiation

The fact that male flowers far outnumber female flowers is a factor that limits nut yield in Chinese chestnut. A naturally occurring mutation of male catkins was found on a single branch of a Chinese chestnut tree in the mountains near Beijing, China. The mutation was named short catkin1 (sck1). The catkin length of sck1 was only 1/6 to 1/8 that of the wild-type male catkins on the same tree. The mutation was associated with a greater number of female flowers and increased yield. Observations on the development of male catkins with the sck1 phenotype showed that the distal part of the catkins aborted at the stage of chestnut staminate flower differentiation. Further research using transmission electron microscope analysis showed that the process of cell death in sck1 catkins had the typical characteristics of programmed cell death at the subcellular level, such as condensed chromatin, dissolved nucleolus, degraded karyoplasm, burst karyotheca, and disintegrated chloroplasts or mitochondria. Significantly, DNA laddering was detected in tissues of sck1 catkins. In conclusion, the results showed that sck1 was associated with PCD.     

板栗新品种‘燕龙’

‘燕龙’是从实生燕山板栗中选育出的新品种,经过无性系后代遗传性测定、区试及示范,表现出寡雄、高产、个大、色好、质优、可短截、适于密植等特性。     

部分板栗品种遗传多样性的AFLP分析

利用荧光标记AFLP技术,采用7对M+3和E+3引物组合对30份板栗和日本栗栽培品种进行了总基因组DNA水平上的多态性检测,共获得962条可统计的条带,其中852条呈多态性,多态性带百分率达89％。揭示了板栗丰富的遗传多样性。7组引物在30个品种中检测到数目不等的品种特异带型,对供试板栗品种具有一定的鉴别价值。7对引物能将30个板栗和日本栗品种完全区分开。聚类分析结果表明,多数来源地相同的板栗品种资源表现出较为密切的亲缘关系。     

‘石硖’龙眼大果型桂花味芽变系的RAPD分析鉴定

 用160个10 bp单个和混和随机引物对‘石硖’龙眼大果型桂花味芽变母树芽变枝及普通枝的基因组DNA进行RAPD扩增分析, 从中筛选出6个单引物( S71、S161、S303、S304、S341、S1212) 和4个双引物( Z7、Z59、Z60、Z70) 能在二者之间扩增出稳定的多态性片段。10个引物共扩增出99条片段, 其中多态性片段有S71-560、S161-813、Z70-800等13条, 占13.1% , 表明芽变枝果实大小及风味的变化与其遗传物质的改变密切相关。用两个特异引物S71、Z70对来源于同一芽变枝不同树龄的芽变嫁接单株及对照进行RAPD扩增, 所得特异片段与引物筛选中完全一致, 进一步表明芽变引起的遗传物质的改变可通过无性繁殖的方式稳定存在, 利用特异引物可对芽变嫁接单株的结果性状做早期预测。     

CmRT1, a Ty3-gypsy-like retrotransposon in Castanea mollissima,is associated with a short-catkin mutation

Summary

Retrotransposons are major components of the genomes of most eukaryotic organisms and have resulted in the introduction of desirable traits in many crops, including fruit trees. Here, we describe a Ty3-gypsy-like retrotransposon associated with a short-catkin mutant in Chinese chestnut (Castanea mollissima), resulting in catkins that are < 20% the length of normal staminate catkins. A partial sequence of the retrotransposon, named CmRT1, detected by amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis, and its complete sequence were determined from the genome of Chinese chestnut (Castanea mollissima) using improved Tail-PCR. CmRT1 was 10,067 bp in length and shared high homology in its predicted amino acid sequence and motifs with other Ty3/gypsy-like retrotransposons. The 5’ long terminal repeat (LTR) of CmRT1 contained a TATA box and several cis-elements that were predicted to be important for processes involving abscisic acid, gibberellic acid, and auxins and in stress-mediated responses. Further characterisation of the transposition event that led to the short-catkin phenotype was performed using two pairs of primers that aligned with the flanking region of the LTRs. The expected PCR bands were observed only in genomic DNA from plants that showed the mutation. Finally, cloning and real-time qPCR analysis of an NADP-dependent alkenal double-bond reductase (CmADBR) target gene that was adjacent to CmRT1, revealed that CmADBR expression was significantly down-regulated in the short-catkin mutant. Taken together, these results suggest that the CmRT1 retrotransposon is responsible for the short-catkin phenotype.     

红阳猕猴桃全红芽变系的RAPD分析

 以10 bp 的随机引物, 通过PCR 技术对猕猴桃全红芽变系86-3 及对照品种红阳的基因组DNA进行扩增, 以探讨芽变系遗传物质的变化。以86-3 母株与红阳为材料对300 条单引物进行了筛选, 得到在两个样品间的扩增有多态性片段10 条引物( S107、S84、S157、S27、S188、AY17、AY5、R11、AV9、AM11) 。10 条引物共扩增出148 个片段, 多态性片段为20 个, 占13.5 %。两样品间相似系数为0.7619 , 遗传距离为0.1429 , 表明86-3 果肉颜色的变化与遗传物质的改变密切相关。用4 种引物S107、S84、S157、AY17 分别对芽变系单株及对照进行RAPD 扩增, 不同树龄、不同砧木的芽变单株与对照间的特异性片段同引物筛选中所得结果一致, 可用所得引物对全红芽变系嫁接株的果肉颜色进行早期预测。     

燕山板栗种质资源遗传多样性的RAPD分析

为研究燕山板栗的遗传多样性,采用随机扩增多态DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术对36份燕山板栗种质进行了分析。分析了燕山板栗的遗传丰富度,并对包括36个燕山板栗品种和8份外来板栗品种在内的44份板栗种质进行聚类分析。结果表明,RAPD能有效地区分品种间的差异,用16个随机引物经PCR扩增共得到132个片段,其中有83个多态性片段,占62.9%;不同遗传位点之间遗传多样度最大可达0.444,最小值为0.096,平均多样度为0.187;UPGMA法聚类,将44份板栗种质聚成4个大的类群,36份燕山板栗可分为3个大的类群,外来种质聚为一类。燕山板栗明显不同于外来品种。在RAPD图谱中,找到了19个品种(类型)的特异性标记和标记组合,可作为品种(类型)分子鉴别的依据。     

富士苹果AFLP体系的优化及其在鉴定早熟芽变中的应用

 以‘长富2号’苹果为材料,采用优化的AFLP技术对其早熟芽变与母株进行初步研究,筛选了64对引物,其中43对引物扩增结果理想,共产生了2,700条带。有4对引物在芽变与母株之间产生了7条差异片段,主要集中在350~800 bp之间。研究表明早熟芽变是由于遗传物质改变造成的,同时也说明利用该体系对苹果芽变进行分析和鉴定获得成功。     

板栗短雄花序异常死亡的超微结构观察

板栗(Castanea mollissima Bl. ) 短雄花序发育过程中, 花序上部变黄, 弯曲, 最后枯死脱落,而基部花序正常发育。利用透射电镜观察花序上部发育中的细胞超微结构发现: 细胞呈现有序的死亡变化,细胞核内发生染色质凝聚, 继而核仁消失, 核质降解, 核膜破裂, 核解体; 液泡内吞现象明显, 形成很多小液泡; 叶绿体和线粒体也逐渐解体; 花序上部衰亡过程中所有细胞器在膜包裹下有序地降解, 表现出植物细胞程序性死亡的典型形态学特征。