扩展莫尼茨绦虫引发酶蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——引发酶蛋白,全长1269 bp,编码422个氨基酸,属于AE_Prim_S家族。编码蛋白的理论分子质量为47.1598 ku,等电点为4.83。获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

扩展莫尼茨绦虫α-tubulin基因的克隆及序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。利用构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因α-tubulin,全长1522bp,编码225个氨基酸,CDS预测属于Tubu-lin_FstZ超家族。编码蛋白的理论分子质量为25808.6KDa,等电点为9.15。获得了扩展莫尼茨绦虫α-tubulin的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤cDNA文库的构建与鉴定

以牛蛙皮肤组织为材料获得总RNA,用偶联Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含Sfi Ⅰ酶切位点的CDSⅢ引物在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1链,以含Sfi Ⅰ酶切位点的CDSⅢ引物和SMART引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经Sfi Ⅰ酶切,通过T4DNA连接酶连接到经过相同酶切的λTripIEx2载体,体外包装后转染E.coli XLI-Blue 宿主菌,进行滴度测试和文库扩增.结果构建的牛蛙皮肤cDNA 文库原始库容量为1.42×106 PFU/mL,插入片段长度在0.5～1.5 kb,重组率为89.5%,扩增后的文库滴度为1.35×109 PFU/mL,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析.     

利用SMART技术构建歪头菜叶片全长cDNA文库

以歪头菜(Vicia unijuga)为研究材料, 用Trizol试剂提取歪头菜叶片组织总RNA, 用SMART TM cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定, 初级文库滴度达到2.3×106 pfu·mL-1, 扩增后文库总滴度为6.2×109 pfu·mL-1, 重组率为92.7%。从扩增后的文库随机挑取16个噬菌斑进行PCR扩增鉴定, 结果显示, 插入片段大多分布在500～2 500 bp。用PCR法从该文库中扩增出了以往用RACE法克隆出的歪头菜木质素合成相关基因CAD 3′端全序列。通过各项指标验证成功构建了歪头菜叶片全长cDNA文库。     

豫南黑猪心脏cDNA文库的构建与鉴定

以豫南黑猪心脏为供试材料,采用改进的异硫氰酸胍法提取心脏总RNA。通过SMART技术反转录合成全长cDNA,经LD-PCR扩增后与pMD18-T载体连接并转化细菌DH5α,测定滴度和重组率,构建成豫南黑猪心脏全长cDNA文库。经初步检测,原始文库的滴度为1.8×10^5cfu/mL,重组率约为94.4%。从原始文库随机挑取13个单菌落过夜培养,提取质粒,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,凝胶电泳显示插入片段大小在0.3～2.0kb之间。     

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因保守结构域所在片段的克隆及原核表达

为了克隆和表达编码扩展莫尼茨绦虫无精症缺失(DAZ)基因,试验根据GenBank中扩展莫尼茨绦虫DAZ基因cDNA序列(登录号为GH291478)设计1对特异性引物,以扩展莫尼茨绦虫组织总RNA为模板,RT-PCR扩增DAZ基因,并克隆到pMD19-T载体中进行序列测定,构建重组质粒pET28a-DAZ,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析表达产物,通过螯合琼脂糖凝胶FF亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明:重组DAZ基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白分子量约为14 ku。     

牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

应用LD-PCR法构建大片吸虫成虫cDNA表达文库

为构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,用Trizol试剂提取大片吸虫成虫总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用LD-PCR扩增方法,合成双链cDNA。用SfiⅠ内切酶修饰此双链cDNA,使形成两端分别带有SfiⅠA和SfiⅠB的黏性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有SfiⅠA和SfiⅠB末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA表达文库。经测定,库容量为1.08×106PFU/mL,重组率为96.6%。扩增后的文库滴度为2.41×109PFU/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。这些结果表明已成功构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,适合进一步筛选大片吸虫新基因。     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。     

荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转－先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1,DAX1)设计引物,构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒,作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品,建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～106拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%),可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法。     

蜜蜂球囊菌全长cDNA文库的构建与分析

本试验利用TRIzol试剂盒提取蜜蜂球囊菌总RNA,通过Oligotex纯化试剂盒将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得蜜蜂球囊菌cDNA原始文库,其滴度测定为1.6×106PFU/mL,扩增后的滴度是1.5×109PFU/mL;取适量扩增文库稀释并铺平板,蓝白斑筛选独立噬菌斑,用M13±通用引物进行PCR扩增后,文库的重组率达到90%,插入cDNA片段的长度在0.5~2 kb。该文库的构建,有利于筛选目的基因,便于深入研究蜜蜂白垩病的侵染机制,最终有效防制白垩病。     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1（+）经BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。     

鹦鹉热嗜性衣原体感染SPF鸡和污染相关疫苗的初步调查

为初步调查SPF鸡感染鹦鹉热嗜性衣原体状况及相关SPF鸡胚源疫苗是否出现污染,本试验通过采集不同日龄的SPF鸡血清70份、SPF种蛋卵黄膜30份,收集市场上销售的SPF鸡胚源疫苗共41支,利用国产间接血凝试剂盒检测抗体,进口免疫荧光试剂盒分别测定其抗体、抗原阳性率,以评价SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体的流行状况和相关疫苗的污染状况。本试验结果显示,SPF鸡血清阳性率分别为31.4%(荧光法)、5.7%(间接血凝法);SPF种蛋阳性率33.3%,SPF鸡胚源疫苗平均阳性率31.7%。SPF鸡已经感染了鹦鹉热嗜性衣原体,且发现经鸡胚卵黄膜而传播病原的新途径,进而造成SPF鸡胚源疫苗出现衣原体污染。因此,加强SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体监测已势在必行。     

甘肃马鹿MyoG基因5′UTR单核苷酸多态性检测及其序列变异分析

为了初步探索肌细胞生成素(MyoG)基因在鹿科动物上的遗传多态性,试验采集56头甘肃马鹿的血液样品,采用PCR-SSCP和克隆测序的方法对MyoG基因(GenBank登录号：FJ746497)5′UTR部分序列进行了单核苷酸多态性(SNPs)检测及序列变异分析。结果表明：①引物P1的PCR扩增片段存在多态性,经克隆测序分析,在5′UTR -237 bp处存在G→A的转换变异,该位点表现为AA、AB和BB 3种基因型,由A和B 2个等位基因控制;对基因型、等位基因频率及群体遗传多态性分析结果发现,AA基因型频率最高,A基因为优势等位基因,该位点多态信息含量(PIC=0.194)为低度多态(PIC＜0.25);经TFSEARCH 1.3分析软件预测发现,该变异可能减少了1个Sp1转录因子。②引物2的PCR扩增片段检测到1个SNP多态位点(—46 bp,G→A),表现为CC、CD和DD 3种基因型, 基因型频率分布为CC＞CD＞DD,该位点多态信息含量(PIC=0.266)为中度多态(0.25＜PIC＜0.5),但该变异并未引起潜在调控元件及蛋白质结合位点的改变。本研究结果为进一步分析MyoG基因SNPs位点与甘肃马鹿胴体、肉质性状的关联性奠定了基础。     

发酵鸡粪中病原微生物检测方法的探讨

鸡粪发酵后作为再生饲料或有机肥已广泛使用,其中病原微生物检测尤显重要,为此本研究对发酵前后的鸡粪样品中主要病原菌大肠杆菌和沙门氏菌检测方法进行了探讨。结果表明,鸡粪样品中大肠杆菌CFU(菌落形成单位)由发酵前3.67×107个/g减少至6.33×105个/g,经发酵处理的鸡粪样品均未检出沙门氏菌,两者与发酵前样品均存在极显著差异(P0.01),说明所建立的方法可行。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。