利用SMART技术构建羊驼皮肤全长cDNA文库

为了快速、经济和有效地寻找新基因,利用大规模测序及分析技术构建羊驼皮肤组织的基因表达谱,实验构建了羊驼皮肤cDNA文库。Trizol提取皮肤总RNA后,用SMART法构建文库：经反转录反应合成第一链eDNA,用LDPCR法将第一链产物再合成第二链和双链cDNA;经蛋白酶K和Sfi消化后,用CHROM AAPIN-400分离双链cDNA;将合适大小的ds cDNA通过16℃过夜孵育使其转入到载体中,将重组产物在22℃下用λ-phage孵育2h进行包装,制成文库。该cDNA文库的特征为：包装效率为10^6（pfu／mL）,重组率在80％以上。该cDNA文库质量可达到进行后续研究的要求。     

利用SMART技术构建歪头菜叶片全长cDNA文库

以歪头菜(Vicia unijuga)为研究材料, 用Trizol试剂提取歪头菜叶片组织总RNA, 用SMART TM cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定, 初级文库滴度达到2.3×106 pfu·mL-1, 扩增后文库总滴度为6.2×109 pfu·mL-1, 重组率为92.7%。从扩增后的文库随机挑取16个噬菌斑进行PCR扩增鉴定, 结果显示, 插入片段大多分布在500～2 500 bp。用PCR法从该文库中扩增出了以往用RACE法克隆出的歪头菜木质素合成相关基因CAD 3′端全序列。通过各项指标验证成功构建了歪头菜叶片全长cDNA文库。     

扩展莫尼茨绦虫α-tubulin基因的克隆及序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。利用构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因α-tubulin,全长1522bp,编码225个氨基酸,CDS预测属于Tubu-lin_FstZ超家族。编码蛋白的理论分子质量为25808.6KDa,等电点为9.15。获得了扩展莫尼茨绦虫α-tubulin的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

扩展莫尼茨绦虫引发酶蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——引发酶蛋白,全长1269 bp,编码422个氨基酸,属于AE_Prim_S家族。编码蛋白的理论分子质量为47.1598 ku,等电点为4.83。获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

绵羊莫尼茨绦虫的防治

<正>莫尼茨绦虫包括贝氏莫尼茨绦虫和扩展莫尼茨绦虫,成虫长约4~10米,宽1.6厘米,寄生于牛羊等反刍动物的小肠内,夺取大量的营养,严重影响动物的生长发育,对羔羊和犊牛的危害严重,有时甚至造成死亡。莫尼茨绦虫体在牛羊和地螨之间形成循环,牛羊将虫卵或孕节随粪便排出体外,虫卵被地螨吞食后,在其体内逸出六钩蚴,经40天左右可在地螨体内发育成感染性的似囊     

扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因的原核表达及抗原性鉴定

为表达扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)的烯醇化酶(Enolase),本研究采用RT-PCR方法以M.expansa 组织总RNA为模板扩增enolase基因,将其克隆到原核表达栽体pET-28a中,并转化BL21 (DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE结果显示表达的重组Enolase约为47 ku.Western blot分析表明,天然蛋白能够被重组表达产物免疫小鼠的血清识别,出现两条免疫印记条带,即天然蛋白以两种形式(约47 ku和40 ku)存在,并具有抗原性,为该蛋白功能研究奠定了基础.     

基于ITS基因分析扩展莫尼茨绦虫种系发育关系

为研究扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列的遗传变异情况,并利用ITS序列探讨扩展莫尼茨绦虫与其它带科绦虫的种群发育关系,本研究利用PCR对扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列进行扩增、测序及分析。结果表明:16株扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列长度一致,为1462~1473bP,且分离株与基因库扩展莫尼茨绦虫位于同一大分支,可以与其它带科绦虫有效鉴别。说明ITS序列种内较为保守,种间差异较大,可以作为扩展莫尼茨绦虫的种间遗传变异研究的分子标记。     

吡喹酮驱除家养林麝感染的四川莫尼茨绦虫

本文描述了为驱除家养林麝的四川莫尼茨绦虫应用吡喹酮15mg/kg,30mg/kg，服药后11-12小时排出虫体，1个月后虫卵转阴率100%。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

应用SMART cDNA合成技术富集鸡脾脏微量RNA

以鸡脾脏中提取的20 ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进.同时与传统cDNA合成方法进行了比较.最终,从20 ng总RNA中成功扩增出双链cDNA 6.03 μg,而采用传统方法只合成出0.03 μg cDNA,且前者cDNA的质量和纯度明显高于后者.结果表明,通过SMART cDNA合成技术,可使鸡脾脏微量RNA得到有效地富集.     

桑树幼叶cDNA文库的构建及部分表达序列标签分析

基于为鉴定和克隆桑树功能基因提供基础信息的目的,采用RNA转录5′末端转换(SMART)法构建了桑树幼叶全长cDNA文库。该文库容量为1.02×106pfu/mL,重组率95%,符合构建基因文库的质量要求。从构建的桑树幼叶cDNA文库中随机挑取48个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为32条,经UniGene数据库归并后为32条,UniGene比率为100%;与NCBI核酸数据库进行比对、查询和注释,在32条序列中有29条序列具有同源性,其中16条为全长序列,完整性比率为55.2%;初步发现具有已知功能基因的ESTs 6个,具有推测功能基因的ESTs 5个,未命名或未知功能基因的ESTs 21个。     

猪蛔虫雄虫cDNA文库的构建

采用Tripure Isolation Reagent抽提猪蛔虫雄虫成虫的总RNA,用poly(A)PuristTM纯化试剂盒分离mR-NA。分离mRNA后,用Clontech公司的CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了猪蛔虫雄虫成虫的cDNA文库。结果获得了7.26×105独立克隆,重组率达96.7%,插入片段的平均长度约为1 kb。猪蛔虫雄虫cDNA文库的成功构建为利用文库筛选雄虫差异表达基因提供了材料来源,为研究猪蛔虫性别发育的分子机制奠定了基础。     

牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。