生长因子对卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨生长因子（ＥＧＦ，ＰＤＧＦ）对牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响，本研究进行了两个实验。实验１：在卵母细胞体外成熟（ＩＶＭ）中，将卵母细胞平均随机的放入表皮生长因子浓度为０，２．５，２５，５０μｇ／Ｌ的成熟培养液和对照组中。实验２：在早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）过程中，将受精卵平均随机分配入５个不同培养液的处理组：（１）ＴＣＭ－１９９＋１０％阉公牛血清（ＳＳ）；（２）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ＋ＰＤＧＦ；（３）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ；（４）ＴＣＭ－１９９＋ＰＤＧＦ；（５）ＴＣＭ－１９９＋无生长因子、其中ＥＧＦ：５０μｇ／Ｌ，ＰＤＧＦ：０．１μｇ／Ｌ。２，３，４，５组有０．１％ＰＶＡ和０．３％ＢＳＡ，并与颗粒细胞单层协同培养。卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）和早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）的方法与Ｌｕ等（１９８７）报道的相同。结果表明：浓度为５０μｇ／Ｌ的处理组分裂率与对照组无差异（８９．０％，９２．４％，Ｐ＞０．０５），而浓度为０，２．５，２５μｇ／Ｌ的处理组分裂率均显著低于对照组（７８．６％，８２．３％，８４．３％，Ｐ＜０．０５），在囊胚率和第７ｄ一级胚胎率上各组均无差异。ＥＧＦ在体     

影响绵羊体外胚胎生产的主要因素

体外胚胎生产能够扩大胚胎来源,降低胚胎生产成本,同时有利于种质资源的国际间交流和拯救濒危动物,因此受到广泛关注(桑润滋,2002)。但目前完全体外化生产胚胎还有很多尚未解决的问题,如囊胚率较低、质量差。本研究着重于系统地探讨体外受精中的一些影响因素,以期为改善绵羊体外胚胎生产技术提供有用的参考依据。     

蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养的影响，通过２３３８个卵母细胞，按２×２×２设计方法进行试验，即在体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养三个阶段的培养液中，添加与不添加蛋白质物质（体外成熟与体外培养为发情母牛血清，体外受精为牛血清白蛋白）。试验结果表明，在体外成熟阶段的培养液中，有无发情牛血清对牛卵母细胞的核成熟无显著影响（有血清组为８９％，无血清组为９０％）。但在体外受精阶段，受精液中含有牛血清蛋白质处理组的卵母细胞受精后，分裂率显著地高于无血清蛋白质组（Ｐ＜０．０１，８４％ｖｓ７２％）。同样，在早期胚胎体外培养阶段，含有发情牛血清的培养液大大促进早期胚胎的发育，与无血清组比较，其差异性极显著（Ｐ＜０．０１，３５％ｖｓ２１％）。同时，含血清组的胚胎孵化率亦显著地高于无血清组（Ｐ＜０．０１，６９％ｖｓ４７％）。本研究表明，蛋白质添加剂在ＩＶＦ和ＩＶＣ阶段是必需的，而在ＩＶＭ阶段则不甚重要。     

重离子束辐照对绵羊卵母细胞及体外受精卵早期发育的影响

试验探索重离子束辐照对绵羊卵母细胞的体外成熟及体外受精卵早期胚胎发育的影响。用不同剂量的重离子束辐照绵羊卵母细胞和精液,观察卵母细胞体外成熟率及体外受精后早起胚胎的卵裂率、桑椹胚率及囊胚率。试验结果显示:与对照组相比,1.0、1.5Gy辐射可以明显提高绵羊卵母细胞的体外成熟率(p0.01);重离子辐照绵羊精液和卵母细胞并做体外受精后,早期胚胎发育有着显著变化。当用0.5、1.0Gy剂量辐照精液时,绵羊早期胚胎的卵裂率和桑葚胚率显著升高(p0.05),囊胚率无显著变化,1.5 Gy剂量,卵裂率显著提高(p0.05),2.0 Gy剂量,卵裂率、桑葚胚率、囊胚发育率均极显著降低(p0.01);当重离子束辐照卵母细胞时,0.5、1.0Gy剂量组的卵裂率、桑葚胚率和囊胚发育率显著升高(p0.05),而2.0Gy剂量组的卵裂率和桑葚胚发育率极显著降低(p0.01),而囊胚发育率为0。结果表明低剂量的重离子辐照绵羊精液、卵母细胞,对体外受精和早期胚胎发育具有明显的促进作用,而高剂量辐照则抑制细胞的生长发育。     

牛卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了牛卵泡液（ＢＦＦ）对牛卵母细胞体外成熟的影响。在成熟培养液中添加１０％的ＢＦＦ，明显提高牛卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率（４５．１％比２８．２％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞体外成熟后的受精分裂率无明显影响（８７．５％比８７．５％）。然而，当ＢＦＦ在成熟培养液中的浓度提高到４０％时，卵母细胞体外成熟后的受精分裂率（６８．６％）和囊胚发育率（１６．６％）均明显下降（Ｐ＜０．０５）。来自不同大小卵泡（２～５ｍｍ，５．１～８ｍｍ和大于８ｍｍ）ＢＦＦ的卵母细胞体外成熟培养效果无明显差异，只是来自大于８ｍｍ卵泡的ＢＦＦ将卵母细胞粘在一起，明显地降低成熟培养后的可用卵母细胞数。在成熟培养液中加入激素（２．５×１０３ｉｕ／Ｌ促性腺激素（ＨＣＧ），５０ｉｕ／Ｌ促乳素，０．０５ｍｇ／Ｌ胰岛素、睾酮和雌二醇）对ＢＦＦ的卵母细胞成熟培养效果无影响。这些结果表明，在成熟培养液中添加一定浓度的ＢＦＦ可促进牛卵母细胞获得胚胎发育能力，ＢＦＦ的这一作用与其来源的卵泡大小和激素的存在与否无关。     

HSP27基因在牦牛卵母细胞和体外早期胚胎中的表达

为了探讨牦牛HSP27(heat shock proteins27, HSP27)基因在牦牛卵母细胞和早期孤雌激活胚胎中的表达情况及定位,本试验通过实时荧光定量PCR检测牦牛HSP27基因在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的相对表达量,用免疫荧光染色法检测HSP27蛋白在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的表达与定位情况。结果显示,HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均可表达,其中在未成熟卵母细胞中的表达量显著高于成熟卵母细胞;在孤雌激活胚胎中,2~4细胞期表达量最高,囊胚期胚胎表达量最低,随着胚胎的发育,HSP27的表达量呈现逐渐降低的趋势;在2~4细胞期和囊胚期胚胎中的表达与其他组表达存在显著差异性,在5~8细胞期和桑椹胚中的表达无显著差异。免疫荧光染色结果表明,HSP27蛋白在牦牛卵丘细胞和卵母细胞中均有表达,在牦牛孤雌激活2~4细胞期、5~8细胞期和桑椹期胚胎中主要表达于细胞核内和细胞质中,在囊胚期主要表达于细胞核中;而HSP27蛋白的表达水平与基因表达水平基本一致。本研究为后续研究HSP27基因在牦牛生殖生理过程中的作用机制提供了参考。     

胎牛血清对猪体外受精卵早期发育的影响

采用猪卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵体外培养技术，探讨了胎牛血清对猪体外受精卵早期发育的影响。结果表明：在猪体外受精卵体外培养的第1天添加胎牛血清可增强早期胚胎发育能力，随着添加时间的延迟，胎牛血清的效果逐渐下降，添加胎牛血清的时间决定了其对猪体外受精卵体外发育的影响。     

表皮生长因子对卵泡刺激素促进的小鼠胚胎卵巢卵泡发育和雌二醇分泌的影响

FSH、EGF是参与卵巢功能调节的重要因素，关于EGF对FSH促进的胚胎卵巢卵泡发育和类固醇激素发生的影响报道甚少。本实验经单个卵巢的总卵泡数、生长卵泡数和5个最大卵母细胞的平均直径为卵泡发育优劣的衡量指标，利用我们早期研究建立的无血清培养体系研究EGF对FSH促进的小鼠胚胎卵巢卵泡发育和分泌雌二醇的作用。结果发现：①EGF＋FSH＋雄烯二酮（A）处理组的胚胎卵巢总卵泡数在培养第7－9d显著高于FSH＋A处理组，而且生长卵泡数和卵巢内5个最大卵母细胞平均直径在培养后期也显著高于FSH＋A处理组（P＜0.05);②FSH＋A处理组的胚胎卵巢在培养第7－9d分泌大量雌二醇，而GF和FSH联合使用时胚胎卵巢的培养早期雌二醇分泌水平显著低于FSH＋A处理组（P＜0.05）。结果提示EGF协同FSH促进小鼠胚胎卵巢卵泡体外生长发育；同时EGF抑制SH诱导的雌二醇分泌，其促卵泡发育作用可能与雌二醇的合成不相关联。     

奶牛体外成熟卵母细胞与X分离冻精体外受精及其胚胎发育

比较了X分离冻精和未分离冻精与牛卵母细胞进行体外受精后,受精卵的卵裂率和胚胎发育率。X分离冻精组受精卵的卵裂率（51.4%）和囊胚发育率（19.7%）显著低于未分离冻精组（67.9%,29.9%,P〈0.05）;微量上浮非离心法处理X分离冻精和未分离冻精后,其受精卵的卵裂率（50.7%,65.5%）高于上浮离心法处理组（48.3%,63.8%）,但两种处理方法之间无统计学差异（P〉0.05）;同一种精子采用微量上浮非离心法或上浮离心法处理后,其卵裂胚的桑葚胚发育率和囊胚发育率无统计学差异（P〉0.05）;X分离冻精的受精卵与颗粒细胞和睾丸支持细胞共培养后,其卵裂率（50.0%,51.4%）与非共培养组（50.3%）无显著差异（P〉0.05）;两个共培养组的桑葚胚发育率（53.3%,54.6%）和囊胚发育率（21.1%,21.5%）均高于对照组（52.2%,20.4%）,但无统计学差异（P〉0.05）。     

氧分压、培养基及微孔对小鼠胚胎体外发育的影响

通过小鼠(Mus musculus)胚胎体外培养,研究了培养基与不同氧分压环境之间是否存在偏好性;同时利用人体呼出的生理混合气体(肺气)对小鼠胚胎体外培养的可行性进行了探索;还比较了微孔(well of the well,WOW)培养法和成组培养法对胚胎发育的影响.结果表明:①在4%CO2+16%O2+78%N2+2%H2O(肺气)、5%CO2+5%O2+90%N2(5%O2,低氧)和5%CO2+20%O2+75%N2(20%O2,高氧)三种气相条件下,CZB和mKSOM两种培养基之间的胚胎卵裂率及囊胚率均差异不显著(P>0.05),但是,在肺气组中,CZB组的囊胚平均总细胞数明显高于mKSOM组(P<0.05);②低氧条件下,mKSOM组的囊胚率(22.6%)显著高于高氧和肺气条件下mKSOM组的囊胚率(P<0.05);③CZB培养基在低氧条件下获得的囊胚率与高氧或肺气条件下所获囊胚率差异不显著(P>0.05);④WOW培养法的囊胚发育率(74.6±5.1%)和囊胚平均总细胞数(76±2)显著高于成组培养法(分别为38.2±6.6%和58±4)(P<0.05).结果提示:培养基mKSOM和CZB在支持胚胎发育时对氧分压具有偏好性;肺气能有效支持胚胎的正常发育;WOW培养法有利于提高胚胎体外发育能力和囊胚质量.     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养

采用胞质内精子注射（ICSI）构建山羊显微受精胚，在两种培养液（CR1aa和SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液（BFF）和胎牛血清（FBS），研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。结果表明：①在CR1aa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高（22．2％），显著高于添加5％（13．1％）和15％（2．7％）组。②在SOFaa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率（25．1％）显著高于添加5％（12．9％）和15％（3．0％）组。③在两种培养液中，分别添加10％BFF和10％FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22．6％和26．9，5．8％和6．1％。表明：CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜山羊的1CSI胚体外培养；在早期胚胎培养中，添加10％BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率：添加10％BFF比添加10％FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。     

卵丘细胞在牛卵母细胞体外受精生产胚胎中的作用

牛体外胚胎生产是解决胚胎移植产业化胚胎来源的有效技术方法,其包括卵母细胞体成熟、体外受精和受精卵体外胚胎.而体外受精胚胎的质量是影响胚胎移植妊娠率与犊牛成活率的重要因素.体外受精过程中卵丘细胞分泌的一些重要物质(类固醇激素、细胞生长因子等),对牛卵母细胞体外成熟、体外受精以及受精卵体外发育都具有重要的促进作用.本文综合了近年来该领域的研究进展,着重分析了卵丘细胞对卵母细胞体外成熟,以及体外受精过程中卵丘细胞的分泌功能、质量和共培养体系对卵母细胞体外受精效率的影响.     

幼畜繁殖（JIVET）技术在性成熟前奶牛上的应用

本实验旨在建立高效的性成熟前奶牛幼畜繁殖(JIVET)技术体系.建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法,平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚:卵母细胞在体外成熟和体外受精过程中,受精率达到63.2%,与成年牛(59.7%)差异不显著.胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%,仍显著低于成年牛(48.0%).对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植,其中2头受孕,1头完成全程妊娠,受孕率达到66.7%.     

未成熟杏离体胚培养技术的研究

本研究以极早熟“骆驼黄”杏品种未成熟离体胚为试材,分别在盛花后３９、４０、４１、４６、４７、５０、５６、５７和５８ｄ采集样品,接种于Ｎｏｒｓｔｏｇ、Ｔｕｋｅｙ、Ｍｓ－Ｒ、ＳＨ、Ｃ２ｄ和改良ＳＨ培养基上,再分别进行０、４５、６５、８０、９０、１００、１１０和１２０ｄ的低温（０￣５℃）处理,研究结果表明,所有供试培养基都能够使杏未成熟离体胚成苗,但是以Ｔｕｋｅｙ培养基为佳,其次依次为Ｎｏｒｓｔｏｇ、Ｓ     

利用自制简易采卵器采集牛卵子并体外受精生产胚胎的初步报道

本研究利用自制的简易牛活体采卵器盲采了8头次母乳牛,共收集到12枚卵子,其中10枚卵子卵质致密均匀、卵丘细胞2－3层,1枚卵子的卵丘细胞稍微扩散,1枚卵子卵质不致密均匀、无卵丘细胞,质量好的卵子比率为83．3％（10／12）,卵子回收数为1．5枚／头／次（12／8）。9枚卵子经体外受精后卵裂率77．8%(7/9);发育形成可移植的桑椹胚和囊胚总数为3个,占总卵母细胞数的比例为33．3％（3／9）,占卵裂数的比例为42．9％（3／7）,囊胚孵化率为50％91／2）。说明了在资金缺乏的国内条件下,可以自制简易、廉价的牛活体采卵器采集具有良好发育潜力牛卵子,通过体外受精技术生产具有遗传价值的牛胚胎,用于商业用途。     

提高小麦X玉米杂交产生单倍体胚的频率

Laurie和Bennett（1986）用普通小麦与玉米杂交，并进行幼胚培养，获得了小麦单倍体植株。但要真正用于育种实践，必须首先获得较高并且相对稳定的得胚率。目前报道的单倍体胚诱导频率差异较大，最高的已达48．6％，最低的不足10％（顾坚等，2005）。本实验通过在2，4-D中加入不同体积浓度的二甲基亚砜，研究其对得胚率的影响。