抑制素基因免疫技术的研究进展

抑制素(Inhibin,INH)是一种由雌性动物的卵泡颗粒细胞和雄性动物的睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素.抑制素免疫可以促进卵巢卵泡发育,提高动物的繁殖力.抑制素基因免疫是近几年发展起来的动物繁殖新技术.通过对基因免疫的优点、效果、影响免疫效果的因素以及基因免疫在养禽业中的应用前景和存在的问题加以阐述,提出了未来研究的方向.     

抑制素基因免疫对黄牛孪生的影响

为增强肉牛的繁殖力,应用本实验室构建的抑制素真核融合表达质粒pCISI,提纯后辅以不同的免疫佐剂注入96头母黄牛体内,采用AMI-900兽用B超对其中84头发情牛进行卵泡检测,并对其中78头妊娠牛进行早期胚胎数目检测。结果发现:抑制素质粒pCISI能促进双大卵泡发育(80.95%,68/84),诱发排双卵(60.71%,51/84),诱导黄牛孪生(41.03%,32/78);普鲁卡因佐剂(48.78%)比脂质体(32.43%)效果明显。研究表明,抑制素基因免疫能有效提高黄牛的繁殖率。     

抑制素基因免疫对南阳黄牛生殖激素的影响

选择40头南阳黄牛,用3.0 mg抑制素基因重组质粒(pCIS,免疫组,n=30)或同剂量的生理盐水(对照组,n=10)间隔21 d注射2次,分别在首次免疫当天、首次免疫后第10天和第21天、加强免疫后第10天和第45天收集血清,应用放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中激素水平.结果表明:在5个采血时间点内,加强免疫后第10天抗体阳性牛比率最高,为37.5%,与其他采血时间点有显著差异.免疫组促卵泡素(FSH)平均含量比对照组高,但差异不显著;17-β雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平在加强免疫后2组有显著性差异.另外.抑制素抗体阳性牛的FSH、E2和P4比阴性牛高,但差异不显著.这些结果说明抑制素基因重组质粒可促进肉牛产生特异性抗体,且对FSH、E2和P4水平有影响.     

黄牛对抑制素pCISI基因免疫的反应性

为分析抑制素基因免疫对黄牛的影响,优化免疫方法,将3.0 mg抑制素真核融合表达质粒pCISI以不同纯度并配以不同的免疫佐剂分2次导入72头母黄牛体内,采用ELISA法检测血样中抗抑制素抗体效价。结果表明:抗体阳性牛占59.72%(43/72);添加佐剂的重组质粒较空质粒组免疫效果明显(P<0.05),普鲁卡因佐剂显著优于脂质体(P<0.05);高纯度疫苗组阳性牛的比例略高于低纯度组,但差异不明显(P>0.05)。这说明应用抑制素质粒pCISI免疫黄牛后可产生抗抑制素抗体。     

不同因素对抑制素基因免疫肉牛反应性的影响

为探讨佐剂、质粒纯度和免疫次数3种因素对抗抑制素抗体效价的影响，以分析抑制索基因免疫是否使内牛产生免疫应答，利用已构建的抑制索真核融合表达质粒pCISI对内牛进行了免疫试验．结果表明，抑制素pCISI基因免疫内牛后佐剂处理组比无佐剂组免疫效果明显．对抗体P/N（待测血样的吸光值P与阴性血样吸光值N的比值）来说，普鲁卡因佐剂显著优于脂质体，但就抗体阳性率来说，普鲁卡因和脂质体差异不显著．无论是抗体P/N值还是抗体阳性率，高纯度组的效果略高于低纯度组，但差异不明显．随着免疫次数的增加抗体P/N值和抗体阳性率均升高，两者差异显著，说明了抑制素基因免疫内牛可诱导产生抗抑制素抗体，纯度对抗体的产生和抗体阳性牛比例没有影响，但免疫佐剂与免疫次数有影响．     

抑制素基因免疫多克隆抗体制备

为制备成本低廉、效价高的抗抑制素抗体,将6只2．5—3kg的健康大白兔分为3组（n=2）,分别皮下多点注射100μg纯化的抑制素质粒pCISI（T1、T22组）或100μg生理盐水（S对照组）,T1组加强免疫1次,而T2组加强免疫2次,每隔10d采血1次,用辛酸-硫酸铵法纯化抗血清;用ELISA法检测血清中抗抑制素抗体水平,以P／N值〉2判为阳性。ELISA检测结果表明,T1、T2组血清中均检测到抗抑制素抗体,效价为1：6400。研究结果表明,抑制素质粒pCISI免疫大白兔可产生较高效价的抗抑制素抗体,且只须加强免疫1次。     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒（pCIS）免疫生产母羊,剂量分别为每只0．2mg、0．4mg和0．8mg,以生理盐水为对照。结果表明：免疫组抗抑制素抗体阳性率达46．7％。加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素（FSH）水平显著高于对照组（P〈0．05）。首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊（P〈0．05）。与对照组相比,免疫组的雌激素（E2）与孕激素（P）水平无显著变化（P〉0．05）。抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响。     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒(pCIS)免疫生产母羊,剂量分别为每只0.2 mg、0.4 mg和0.8 mg,以生理盐水为对照.结果表明:免疫组抗抑制素抗体阳性率达46.7%.加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素(FSH)水平显著高于对照组(P＜0.05).首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊(P＜0.05).与对照组相比,免疫组的雌激素(E2)与孕激素(P)水平无显著变化(P＞0.05).抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响.     

抑制素α(1～32)基因免疫对大鼠卵泡发育和生殖激素的影响

 选择 40只 3 0日龄雌性大鼠分为 4组 ,分别用含重组抑制素α(1～ 3 2 )基因真核表达质粒pcINH 0 μg(对照组 )、15μg(试验组 1)、2 5μg(试验组 2 )、40 μg(试验组 3 )的脂质体进行主动免疫 ,间隔 2 0d后用不含脂质体的重组基因质粒加强免疫 1次。结果发现 ,抗体阳性鼠占 50 % (13 / 2 6) ,但加强免疫 10d后的抗体P/N值没有升高 ,而且免疫剂量的增加并没有提高阳性鼠的比例 ;抗体阳性鼠卵巢上的成熟卵泡数比阴性鼠多 2 .3 ,但统计差异不显著 (P >0 .0 5)。首次免疫 10d后阳性鼠血浆FSH浓度显著升高 (P <0 .0 5) ;但血浆雌二醇水平无显著差异 (P >0 .0 5)。加强免疫 10d后血中促卵泡素水平没有升高。本试验结果证明 ,应用重组抑制素真核表达质粒免疫动物可以产生抗抑制素抗体。     

抑制素基因免疫京白鸡后在心脏组织中的表达

[目的]探讨基因免疫的安全性。[方法]抑制素基因免疫京白鸡后,取其心脏组织制备石蜡切片,再利用免疫组化方法检测心脏组织切片中是否有抑制素基因残留（即是否有阳性点的存在）。[结果]在心脏组织切片中,试验组和对照组均无阳性点。[结论]抑制素免疫后京白鸡的心脏组织中无外源抑制素表达,说明抑制素基因免疫是安全的。     

抑制素基因免疫黄牛的黄体发育与免疫纯度及剂量的关系

为探讨双拷贝抑制素pcISI基因疫苗纯度和剂量对肉牛黄体发育的影响,将150头同期发情的南阳黄牛随机分为8个试验组和2个对照组,试验组用pcISI按2种纯度、4种剂量(0.75、1.50、2.25、3.00 mg/头)进行免疫处理,2个对照组分别用空质粒和生理盐水进行处理;初次免疫21 d后进行加强免疫。结果表明:无论用高纯度还是低纯度疫苗免疫,2.25 mg/头剂量处理对黄体的作用效果最明显,且抗体水平与黄体发育密切相关,2.25 mg/头抑制素融合表达质粒组的黄体显著大于0.75 mg/头组(P<0.05),抗体阳性牛两侧黄体显著比抗体阴性牛的大(P<0.05)。     

抑制素基因疫苗的构建

使用猪抑制素α亚基上的第1－32位所基酸所对应的DNA片段作为目的基因，并与乙肝表面抗原基因串联，插入原核表达质粒（pUC18)中，构建重组原核表达质粒，经过在大肠杆菌中扩增后提取目的基因片段，手稿真核表达质粒(pcDNA3.0）中，构建重组真核表达质粒，经过扩增和提取，并经过测定获得了抑制素基因疫苗。     

tlr4基因对羊肠道细菌影响的研究

【目的】通过分析tlr4基因对羊肠道主要细菌数量的影响,评价转基因羊tlr4的生物安全性。【方法】收集15只转基因羊tlr4和15只非转基因羊的粪便样本,采用传统平板培养法和实时荧光定量PCR法(quantitative Real-Time PCR,qPCR)分析转基因羊tlr4和非转基因羊肠道中主要细菌数量的变化。【结果】传统培养法的结果表明,转tlr4基因对羊肠道中大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、粪肠球菌(Enterococcus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)的生长均有一定程度的抑制作用,在数量上转基因羊tlr4和非转基因羊的差异不显著(P0.05);qPCR法的结果表明,转tlr4基因对羊肠道中大肠杆菌、双歧杆菌、拟杆菌(Bacteroides)和粪肠球菌的数量亦无显著性影响(P0.05)。【结论】显示抗病基因tlr4处理对羊肠道主要细菌基本无显著性影响。     

生长抑素DNA疫苗对湖羊羔羊生长和相关激素的作用——佐剂效应

选择60只断奶湖羊母羔羊,分为6组,1～5组为免疫组,分别用pES/2SS pE-CpG、pES/2SS 细菌DNA、pES/2SS-GMCSF、pES/2SS脂质体和pES/2SS免疫,第6组为对照组.结果显示,首次免疫4周和加强免疫2周后,细菌DNA佐剂组的抗生长抑素抗体水平显著高于pES/2SS单独免疫组(P＜0.05),其抗体阳性率也最高,达50%.比较全期14周免疫羊的体质量增加情况,最优为pE-CpG佐剂组,其次为细菌DNA佐剂组,分别比对照组高33.0%和31.6%(P＜0.01),且显著高于pES/2SS单独免疫组(P＜0.05).加强免疫2周后,免疫组GH和IGF-Ⅰ水平显著高于对照组(P＜0.05),抗体阳性羊的GH和IGF-Ⅰ水平极显著高于抗体阴性羊(P＜0.01).结果表明:几种佐剂配合pES/2SS免疫,产生了免疫佐剂效应,能增强生长抑素DNA疫苗的免疫效果.     

生长抑素基因疫苗对肉用鸡生产性能、屠宰性能及肌肉品质的影响

将28日龄150只肉用鸡随机分为5个组,每组30只,A、B、C组口服生长抑素基因疫苗,剂量分别为8×109、4×109、1×109 cfu·只-1,D组口服生理盐水,E组口服减毒沙门氏菌CS022,作为对照组,2周后加强免疫1次,分析以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素基因疫苗对肉用鸡生长性能、屠宰性能及肌肉品质的影响.结果...     

DNA去甲基化对马立克氏病病毒(MDV)基因表达的影响

以鸡马立克氏病脾脏淋巴瘤继代细胞系MDCC-MBI(MSB1)为研究对象，用southern和northern斑点分子杂交放射自显影等方法，证明了5-氮胞苷可以阻断MSB1细胞DNA的甲基化，且去甲基化的DNA转录区和部分非转录区有特异增幅的转录产物mRNA，说明这些区基因转录活性上升。用5-氮胞苷处理MSB1细胞使其去甲基化后，该细胞DNA的内切酶Barn HⅠ区域对DNaseⅠ敏感性增高，该片段区的基因表达活性也增高。以上结果提示．DNA的去甲基化可以提高MDV的基因表达，进一步说明MDV DNA的甲基化在抑制MDV基因表达，维持MDV在淋巴瘤细胞株中潜伏感染状态可能起着重要作用。     

IL-15基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

为弄清犬白介素-15(cIL-15)能否增强犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究首先通过RT-PCR方法从犬脾脏淋巴细胞中扩增全长cIL-15cDNA基因,并构建其与Myc-His-tag融合和非融合的表达载体:pcDNA-cIL-15/MH和pcDNA-cIL-15。将pcDNA-cIL-15/MH载体转染HEK293T细胞,确定构建的表达载体能否介导cIL-15进行分泌表达。利用过去构建的VP2表达载体和pcDNA-cIL-15载体共免疫小鼠,用ELISA检测免疫后小鼠血清中的抗体滴度,并用MTT检测小鼠淋巴细胞的增殖活性和用ELISA测定淋巴细胞干扰素-γ和IL-4的表达。结果显示,构建的cIL-15表达载体能够介导cIL-15在真核细胞中的分泌表达。用VP2和cIL-15表达载体共免疫小鼠,抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P0.01)。当免疫35d时,共免疫组淋巴细胞的刺激指数、干扰素-γ和IL-4的表达水平均明显高于VP2载体单免疫组(P0.05)。结果表明,cIL-15可明显增强VP2DNA疫苗的免疫原性。