减毒沙门氏菌作为口服活疫苗载体的研究进展

文章就沙门氏菌相关基因的特点、减毒沙门氏菌载体激发的免疫应答、进入机体免疫系统的机制、减毒沙门氏菌的应用、载体疫苗的优越性及潜在危险性几方面综述了减毒沙门氏菌作为口服疫苗载体的研究进展,为新型菌苗的研制提供一种新的思路。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的研究进展

减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗是通过基因工程手段等方法将鼠伤寒沙门氏菌减毒,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌将外源蛋白或抗原基因运送到机体免疫细胞内,诱导机体产生特异性免疫应答。近年来,国内外学者已通过多种方法构建了不同疾病的减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,其展示了良好的应用前景。本文主要对鼠伤寒沙门氏菌的生物学特性、减毒途径、应用现状及应用前景进行阐述。     

减毒沙门氏菌载体构建策略研究进展

减毒沙门氏菌能诱导粘膜、体液及细胞免疫,不仅其自身能够产生免疫效应,而且还能携带外源基因诱导宿主特异性应答,是具有广泛应用前景的疫苗载体。本文从减毒致弱菌株构建、外源基因高效表达等方面综述了减毒沙门氏菌载体构建策略的新进展,进而对减毒沙门氏菌活载体应用中待解决的科学问题进行了归纳。     

沙门氏菌的基因工程减毒以及在DNA疫苗载体中的应用

沙门氏菌是最常见的人畜共患的重要病原菌,引起人和动物肠热症、胃肠炎、败血症等,呈全球性分布.通过基因工程技术对沙门氏菌进行减毒,感染宿主细胞后可在体内长期存活并诱导产生保护性免疫反应.同时,沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌,减毒沙门氏菌运载编码有外源基因的真核表达质粒可在体细胞内进行持续表达,诱导产生特异性的体液和细胞免疫应答.因此,减毒沙门氏菌既可作为针对同源抗原的活疫苗,也可作为诱导针对其他病原微生物产生保护性反应DNA疫苗的载体[1].本文综述了沙门氏菌的基因工程减毒以及在DNA疫苗载体中应用方面的最新进展.     

减毒鼠伤寒沙门氏菌载体在兽医疫苗中的运用

重组疫苗的研究中,减毒鼠伤寒沙门氏菌可以作为真核表达载体。其原理是将免疫原基因片段连接到某种真核质粒中,然后将质粒导入减毒鼠伤寒沙门氏菌,构建针对该特异病原的重组活疫苗。本文介绍了减毒鼠伤寒沙门氏菌作为DNA载体,在动物细菌、病毒和支原体重组活疫苗中的运用。     

减毒沙门氏菌载体在兽用疫苗研发中的应用

减毒沙门氏菌可以作为DNA疫苗载体表达外源抗原基因,已受到医学界的广泛重视。本文对沙门氏菌的减毒、载体疫苗的优越性及作为口服活载体疫苗在动物病毒、细菌和寄生虫疫苗的最新应用成果进行了综述。     

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；在体内稳定试验中，经ICR小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后，观察1个月未见有异常现象，同时剖栓后也未见脏吕有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理的提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中亦有重要应用价值。     

核酸疫苗的运送载体-减毒鼠伤寒沙门氏菌

以染色体-质粒平衡致死系统为特征的减毒鼠伤寒沙门氏菌是一种有效的基因递呈载体,突变菌体通过入侵到宿主的派伊尔氏结,进而被抗原递呈细胞如树突状细胞和巨噬细胞吞噬,最终将突变菌体携带的外原基因导入真核细胞并在其中表达,从而诱导机体产生针对外原基因的黏膜、体液和细胞免疫应答,期间,减毒沙门氏菌起到免疫佐剂的作用。这为发展高效免疫,低成本的口服活疫苗提供了一个新的思路。文章着重就沙门氏菌的减毒基因?平衡致死系统以及免疫应答的机制等做以综述。     

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达弓形虫SAG1基因

将PCR扩增获得的弓形虫SAGI基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3-SAG1真核表达质粒,高压电转化入dam和PAOP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,并直接转染Vcro细胞,胰酶消化、收集细胞,SDS-PAGE和western blot可检测到30 ku左右的蛋白条带和印迹带.结果表明减毒沙门氏菌能将外源基因呈递给Vero细胞并进行表达.     

减毒沙门氏菌运送的口服DNA疫苗研究进展

DNA疫茁被誉为疫苗技术领域一场新的革命,但如何优化质粒DNA的免疫途径和运送方法以激发有效的免疫应答成为研究的热点.采用减毒胞内菌通过黏膜自然感染途径运送DNA疫苗成为近年来研究的热点[1].沙门氏菌是一类重要的人兽共患病原菌,目前利用它作为载体原核表达各种外源抗原已得到广泛的研究并取得良好的免疫效果;而利用沙门氏菌作为DNA疫苗运送载体的研究方兴未艾,已显示出诱人的前景.本文就减毒沙门氏菌作为外源DNA运送系统的入侵途径、诱导产生免疫应答的机制以及免疫预防传染病等方面的应用作简要综述.     

表达RGD和MEL重组沙门氏菌的构建及其对B16细胞凋亡作用的研究

为研究融合表达肿瘤靶向肽(RGD)和蜂毒肽(MEL)双基因重组减毒沙门氏菌对小鼠黑色素瘤B16细胞的体外抑瘤作用,本实验将RGD-MEL基因片段克隆至pEGFP-N1载体,将重组载体导入减毒沙门氏菌LH430,构建了重组沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL,经PCR技术、质粒双酶切鉴定后采用阳性重组菌株侵染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞,提取细胞总RNA经反转录后采用PCR检测目的基因RGD-MEL转录情况,western blot检测目的蛋白RGD-MEL以及凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax的表达;流式细胞术检测B16细胞凋亡情况。结果显示:导入RGD-MEL基因的减毒沙门氏菌LH430侵染B16细胞后,目的基因RGD-MEL高效表达;经重组菌株侵染的B16细胞凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax表达水平均显著增高(p<0.05);重组沙门氏菌诱导B16细胞的凋亡作用较PBS组显著增强(p<0.05)。本研究为细胞穿膜肽和细菌联合治疗肿瘤提供实验支持,并为后续动物试验奠定了研究基础。     

作为疫苗和疫苗载体的胞内细菌

本文综述了结核分支杆菌、单核细胞增生性李斯特菌和沙门氏菌等胞内细菌作为疫苗物质和载体。目前，人们正在考虑预防这些病原体的新的免疫预防策略。策略之一就是使用胞内菌的减毒活菌疫苗以及减毒细菌疫苗载体。这一策略包括两方面的工作，即减毒疫苗菌株的改良和重新构建强毒菌株的减毒突变体。另一种策略是应用亚单位疫苗免疫，如核酸疫苗或病原体的蛋白抗原。     

外源基因在减毒沙门氏菌载体中的遗传稳定性和表达

减毒沙门氏菌接种机体后,能够诱导自身及所携带的外源基因免疫,是具有前景的重组疫苗。文章简要介绍了减毒沙门氏菌菌株及外源抗原基因表达产物的免疫应答,重点讨论了提高外源基因在沙门氏菌中的稳定性和表达量这两方面问题。     

减毒沙门氏菌为载体的草鱼口服生长抑素DNA疫苗的构建及其稳定性

将生长抑素(SS)和乙肝表面抗原基因(HBsAg)融合后，插入真核表达载体pcDNA3，构建成pcDNA3-SS，再转化减毒沙门氏菌(S．typhimurium,dam^-和phop^-)，构建了以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素口服DNA疫苗ZJ111／pcDNA3-SS，并通过体外传代、灌服草鱼检验了ZJ111／pcDNA3-SS的侵袭力及体外和侵入草鱼体内过程中的德定性。对草鱼肝脏和脾脏分离菌的生化特性检验和特异性PCR鉴定表明，ZJ111／pcDNA3-SS能很好地侵入草鱼体内；对在Amp^ 、Amp^-平板上传5、10代和灌服7d后草鱼肝、脾脏分离的减毒菌抽提重组质粒进行PCR和酶切鉴定表明．减毒菌中的重组质粒在体外和侵入草鱼体内过程中具有较好的稳定性。     

减毒沙门菌介导的apo-tPA融合基因在鸡体组织的分布与表达

探讨以减毒沙门菌为载体,介导外源基因在动物体内的组织分布和表达的可行性。将编码人t-PA功能区的基因片段与鸡VLDLy组装前体apo-B100基因融合,定向克隆到荧光蛋白表达载体SV40启动子下游,构建pApo-tPA-GFP表达质粒。应用电转化法将pApo-tPA-GFP表达质粒转化减毒沙门菌,阳性减毒沙门菌经翅下静脉注入鸡体内,分别于注射后第1、2、3、4、5周随机剖检试验用鸡,无菌取内脏器官,经组织细菌培养、RT-PCR检测各脏器中基因分布,涂片荧光镜检基因表达情况。结果显示,在肝脏、脾脏和十二指肠均分离到沙门菌,PCR鉴定均为减毒沙门菌载体;RT-PCR检测在肝脏、脾脏、十二指肠中有目的基因存在;荧光检测在肝脏、脾脏中有荧光蛋白。结果表明,减毒沙门氏菌能够作为载体将目的基因有效的转入到动物体内,这一方法有望为动物转基因提供便捷、有效的途径。     

以减毒沙门氏菌为载体的GM-CSF与生长抑素DNA疫苗的安全性和稳定性

将含GM-CSF基因与生长抑素(SS)的融合真核表达质粒pGM-CSF/SS转入减毒沙门氏菌株CS022。选择40只22~24 g的雌性小鼠,随机分成4组,其中1组为对照组,口服生理盐水;2~4组为试验组,分别用上述重组减毒沙门氏菌株CS022以108、109、1010CFU的剂量口服免疫小鼠,2周后以相同的剂量加强免疫,研究pGM-CSF/SS真核表达质粒在体内的稳定性和减毒沙门氏菌对小鼠的安全性。同时通过体外传代,研究该真核表达质粒在体外的稳定性。结果表明:108、109CFU剂量口服小鼠,成活率达100%,而1010CFU剂量口服小鼠成活率降低至90%,腹泻率达50%。体外传10代和口服免疫4周后从小鼠肝脏和脾脏分离的减毒菌用琼脂糖凝胶电泳和酶切鉴定法证实,减毒菌中的重组质粒在体外和侵入小鼠体内过程中具有较好的稳定性。质粒DNA在传10代以后,虽然每代的质粒DNA含量有些变化,但总体趋势基本是恒定的,第10代时,质粒DNA的含量与第1代的含量差异不显著。上述结果提示,利用该减毒沙门菌作为载体传递pGM-CSF/SS DNA疫苗免疫小鼠具有相对安全性和稳定性,为进一步有效激发机体的免疫应答提供了前提。     

重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡体内主要组织器官定植情况检测

为检测重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13（pcDNA3-HN）在雏鸡体内主要组织器官定植情况,本研究将120只1日龄雏鸡随机分成3组,分别用减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13、重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13（pcDNA3-HN）和PBS免疫,在免疫后4、24、48、72、96、120、144及168 h,分别检测减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13和重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13（pcDNA3-HN）在雏鸡心脏、肝脏、脾脏、盲肠和血液的定植情况。结果显示,在免疫后24 h减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13在血液中数量达到了一个峰值,24～48 h血液细菌数量下降,48～96 h血液中细菌数上升并在96 h达到另一个峰值,96～168 h血液中细菌数量下降,在心脏、肝脏、脾脏、盲肠这几个脏器中,细菌的数量分别在4～72 h呈上升趋势并在72 h达到峰值,72～96 h脏器细菌数量下降,96～120 h菌数上升并在120 h达到峰值,随后细菌数量下降;免疫重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13（pcDNA3-HN）组在雏鸡各脏器细菌总数变化及定植情况与ΔcrpC79-13相似。结果表明,重组菌株ΔcrpC79-13（pcDNA3-HN）与亲本菌株ΔcrpC79-13均可在雏鸡心脏、肝脏、脾脏、盲肠等器官定植,且在各脏器中菌株定植变化趋势一致但数量下降。     

重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡体内主要组织器官定植情况检测

为检测重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡体内主要组织器官定植情况,本研究将120只1日龄雏鸡随机分成3组,分别用减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13、重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)和PBS免疫,在免疫后4、24、48、72、96、120、144及168h,分别检测减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13和重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡心脏、肝脏、脾脏、盲肠和血液的定植情况。结果显示,在免疫后24h减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13在血液中数量达到了一个峰值,24~48h血液细菌数量下降,48~96h血液中细菌数上升并在96h达到另一个峰值,96~168h血液中细菌数量下降,在心脏、肝脏、脾脏、盲肠这几个脏器中,细菌的数量分别在4~72h呈上升趋势并在72h达到峰值,72~96h脏器细菌数量下降,96~120h菌数上升并在120h达到峰值,随后细菌数量下降;免疫重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)组在雏鸡各脏器细菌总数变化及定植情况与ΔcrpC79-13相似。结果表明,重组菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)与亲本菌株ΔcrpC79-13均可在雏鸡心脏、肝脏、脾脏、盲肠等器官定植,且在各脏器中菌株定植变化趋势一致但数量下降。     

携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究

为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。