2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征

为了调查2006-2008年山东省鸡传染性支气管炎的分子流行病学特征,应用RT-PCR方法分别扩增了14株传染性支气管炎病毒地方毒株S1基因和N基因,并进行了基因克隆与测序工作.对此14株病毒的S1基因序列利用限制性内切酶HaeⅢ进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析,结果显示可以将IBV毒株分为3种不同的基因型.其中11个毒株与LX4毒株有相同的RFLP分型,2株病毒属于Mass基因型,1个毒株有特异的RFLP分型.并将这些分离毒株与11个参考毒株分别进行了基因与氨基酸系统进化树关系分析.S1基因分析结果显示将这些毒株分成3个基因型,与RFLP分析的分型结果一致.11株病毒同属于LX4类型的毒株,分离毒株核苷酸序列相互之间有95.4%～99.7%的同源性.基因Ⅱ型与疫苗株H120和M41的同源性很高.属于基因Ⅲ型的1个毒株形成了独特的基因型.N基因分析结果表明:12株病毒与LX4属于同一基因型,有着较高的同源性.另2株病毒与疫苗株H120同源性很高.以上分析结果表明:山东省IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是山东省IBV变异株产生的另一主要原因.     

RT-PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1糖蛋白基因 (引物A)和S1糖蛋白基因N_端高变区Ⅰ (引物B)的 2对引物对 3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及 5个地方分离株 (C60 ,D41A ,D41B ,A112 1,A1171)进行RT_PCR扩增。用引物A时 ,有 5个IBV毒株扩增到目的片段 (172 0bp) ;用引物B时 ,所有 8个IBV毒株均得到与预计大小相符的目的产物 (2 2 8bp)。对 172 0bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切 ,结果得出 3个不同的RFLP图谱 ,其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HaeⅢ酶切图谱。Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱 ;对 2 2 8bp的PCR产物进行DdeⅠ、RsaⅠ限制性内切酶消化 ,根据它们的RFLP图谱 ,8个IBV毒株可分为 5个基因型。综合 2对引物的PCR产物的RFLP分析结果 ,8个IBV毒株可分为 7个基因型 ,分型的结果与传统的血清学方法吻合。本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异、灵敏等优点 ,为现场流行毒株的定型(基因型 /血清型 )及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

RT—PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1整个S1糖蛋白基因（引物A）和S1糖蛋白基因N-端高变区I（引物B）的2对引物对3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及5个地方分离株（C60，D41A，D41B，A1121，A1171）进行RT-PCR扩增，用引物A时，有5个IBV毒株扩增到目的片段（1720bp)；用引物B时，所有8个IBV毒株均得到与预丈夫大小相符的目的产物（228bp)，对1720bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切，结果得出3个不同的RFLP图谱，其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HacⅢ酶切图谱，Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱；对228bp的PCR产物进行DdeI、RsaI限制性内切酶消化，根据它们的RFLP图谱，8个IBV毒株可分为5个基因型，综合2对引物的PCR产物的PCR产物的RFLP分析结果，8个IBV毒株可分为7个基因型，分型的结果与传统的血清学方法吻合，本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异灵敏等优点，为现场流行毒株的定型（基因型/血清型）及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因的克隆及其鉴定

用自行设计的 1对引物 you1 和 you2 -对 5个传染性支气管炎病毒 (IBV)地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC4)的基因组 RNA进行 RT- PCR,均成功地扩增出预期大小 (约 16 30 bp)的目的片段 ,经 PCR、酶切鉴定为 S1基因。将 5个毒株的 S1基因克隆到 p GEM- T载体中 ,重组质粒经 Eco R 和 Hind 单酶切以及用引物 you1 和 you2 -进行质粒 PCR扩增鉴定 ,证明 IBV- S1基因已成功地克隆到了 p GEM- T载体中。同时 ,为了测序的方便 ,还将 IBV- S1基因作了目的片段 (约 10 6 0 bp)的亚克隆并进行了鉴定     

RT—PCR和RFLP对我国部分传染性支气管炎病毒分离株分型

用2 对引物分别对4 株传染性支气管炎病毒(IBV)标准毒株(Gray、M41、H120、MA5)和5 株国内地方分离株(KF8、18KF7、QF3、XF7、XF18)进行RT-PCR,结果均获得了与预期大小一致的片段。对此2 种PCR 产物进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析,分别用3 种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、PvuⅡ)进行酶切,根据不同的酶切图谱将测试的IBV 毒株分为不同的基因型。2 对引物的PCR 产物酶切分型结果基本一致。9 株IBV 毒株分为3 种基因型,即H120、M41、XF7、XF18、MA5 和KF8 属于Ⅰ型,Gray 属于Ⅱ型,QF3、18KF7 属于Ⅲ型     

传染性支气管炎病毒山东及北京分离株血清型及RFLP基因分型的比较研究

分离并鉴定出山东省不同地区的IBV分离株A、B、C、D和北京分离株F，利用中和试验分别对各分离株及标准株M41、T等进行血清分型。设计一对此物，分别对各毒株的S1基因进行RT－PCR扩增，扩增片段长约1700bp，利用其PCR产物进行HaeⅢ酶切，根据酶切图谱，进行基因分型。结果表明：A、C、D和M41酶切图谱相同，属Mass基因型，分别为900、400和300bp左右的片段；北京F株有4条酶切条带，与4／91基因型不同，分别为1000、300、200和小于100bp左右的片段；B株有4条酶切条带，理论推断与T株相似，分别为700、500、300和180bp左右的片段，可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。     

4株IBV中国地方分离株部分结构基因变异的研究

本研究通过RT-PCR分别获得了4个国内IBV分离株的S1、M和N基因，并进行了克隆及测序。序列分析结果表明：HaN2-95株的S1、M和N基因核苷酸序列均与IBV H120疫苗株的同源性最高；尽管HaN1-95株的S1基因与IBV H52疫苗株的亲缘关系最近，但是该毒株的M基因和N基因却与IBV Gray株的同源性最高；GX1-98株的S1和M基因均与IBV H52疫苗株的亲缘关系最近，但其N基因却与IBV Gray株和Ark99株有高度的同源性；GX2-98株的S1基因却与IBV Holte株的亲缘关系最近。上述结果提示国内有些IBV分离株的出现可能与疫苗株的使用有关。     

IBV 3株分离株的血清中和试验及S1基因同源性分析

通过血清中和试验、RT-PCR、核酸序列分析和S1基因的同源性分析，表明鸡传染性支气管炎病毒（IBV）BJ9601、HN9604与M41株的血清中和效价最高，其次为H120，TJ9602与试验毒株的血清中和效价较低。BJ9601、HN9604的S1基因与H120和H52的同源性很高，与H120和H52同在一个分支，其来源与H120或H52有密切关系。TJ9602的S1基因只与LDT3的同源性达到93％，共同形成一个分支，与其他毒株的同源性均在88％以下。血清中和试验和S1基因同源性之间存在较高的相关性，但并不能达到完全的吻合，即血清中和效价最高的毒株之间S1基因的同源性并不是最高的。在GenBank中登记的IBV中国大陆分离株的S1基因可分为3个基因群，其中Ⅰ群和Ⅱ群是主要的流行毒株，共有38个分离毒株，占90．48％。     

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。     

鸡新城疫地方强毒SC01株HN基因片段的克隆与分析

用设计的1对特异性引物，对一株从成都地区分离的鸡源性NDV强毒SC01株的HN基因的526bp片段进行克隆与分析。分析结果表明，SC01株HN基因与相比较的12株鸡源性毒株的HN基因的核苷酸同源性为81．4％-94．6％，核苷酸所推导的氨基酸同源性为88．0％～94．8％。对SC01株和CH185、F02、GD／1／98／goose、YG97、JS／3／98／goose、JS／5／01／goose、JS／2／98／goose等毒株的HN基因进行聚类分析，证明它们属同一亚群，SC01株属于NDV基因Ⅶ型毒株，证明了基因Ⅶ型NDV毒株在四川地区存在。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT-PCR扩增及其克隆与鉴定

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶＳ１全基因特异性引物分别从我国华东（ＨＤ）、华北（ＨＢ）、华中（ＨＺ）、华南（ＨＮ）、西北（ＸＢ）及东北（ＤＢ）等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅＩＩ酶切分析及其与英国ＩＢＶＳ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶＳ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５’和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切识别位点的分子修饰之后插入到克隆质粒ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。Ｓ１基因的ＲＦＬＰ分析表明我国ＩＢＶ已有分子水平的变异。     

Production and characterization of monoclonal antibodies to (poly100)S1 protein of avian infectious bronchitis virus

Fragments within S1 genes ((poly100)S1) of infectious bronchitis virus (IBV) strains ZJ971, M41 and SC021202 (SC) were subcloned into a prokaryotic expression vector and expressed in Escherichia coli. Monoclonal antibodies (mAbs) against the recombinant (poly100)S1 proteins were produced, characterized and used to analyse epitopes on the S1 subunit of IBV. Nine mAbs raising from the three (poly100)S1 proteins recognized five different epitopes of the S1 subunit, designated as S1-A, B, C, D and E. Epitopes S1-C and S1-D are common for the three IBV strains, while S1-A and S1-B exist on ZJ971 and M41 strains, and S1-E was a strain-specific epitope for SC strain. Immunocytochemistry indicated that all the mAbs to the (poly100)S1 proteins can react with the homologous S1 glycoprotein expressed in Vero cells. Moreover neutralization test demonstrated that only mAbs 6E2, 4F9 and 6G4 had neutralization activity for the homologous IBV. These mAbs to (poly100)S1 protein were potential candidates for detecting and distinguishing IBV strains, and also used to examine antigenic variation of the S1 protein.     

Isolation and identification of four infectious bronchitis virus strains in China and analyses of their S1 glycoprotein gene

Between 2003 and 2005, four strains of infectious bronchitis virus (IBV) were isolated from the vaccinated chicken flocks in China. The results from chicken embryo cross-neutralization assays showed that all the four isolates were relative to strain A2 of IBV, which was isolated in 1996 in Beijing and related to strain 4/91. The S1 gene of the spike protein was amplified and sequenced. The nucleotide and amino acid sequence of the S1 gene had a similar degree of identity (88.98-99.28%) among the four Chinese IBV isolates. The identity of the S1 protein gene between the four Chinese IBV isolates and 14 strains of other IBVs varied from 70.06 to 81.59%. Phylogenetic analysis suggested that there are at least four groups of IBVs circulating in China and the disease outbreaks might have been caused by infection of multiple strains of IBV.     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株S1基因的克隆与序列测定

根据基因库中收录的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因的序列 ,设计了一对引物并采用RT -PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒HN99株的S1基因 ,扩增产物进行了克隆、测序 ,获得了IBVHN99株S1基因片段 ,其大小为1 739bp(含前导序列 ) ,其核苷酸序列与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte的S1基因核苷酸序列同源性较低 ,分别为 79.1 %,79.2 %,77.3%,77.8%,79 .4%,有大量的点突变并伴有基因插入和缺失 ;IBVHN99株的S1基因推导的氨基酸与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte株氨基酸的同源性分别为80 .1 %,79.9%,79.5%,78.5%,78.5%,经S1基因系统进化分析 ,提示IBVHN99株与其它各毒株的亲缘关系较远 ,初步证实IBVHN99株为一新的IBV毒株     

4株鸡肾型IBV陕西分离株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

采用RT—PCR方法对近年来本实验室分离的4株肾型IBV陕西分离株的纤突蛋白S1基因、膜蛋白基因（M）和核蛋白基因（N）分别进行扩增,测序后进行遗传变异分析。结果显示：与肾型疫苗株w93相比,各分离株S1基因均存在广泛的点突变,并且都存在基因插入现象,分离株之间氨基酸同源性为75．8％～99．4％;M基因除了存在点突变外,W09和WNl2在其5’端还存在9个核苷酸的缺失,分离株之间氨基酸同源性为91．0％～99．6％;N基N无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为99．3％～99．5％。4株IBV分离株在S1、M和N基因氨基酸系统进化树上分属于不同的进化群,且都与较早的肾型IBV陕西分离株w118遗传距离较远。结果表明,4株鸡肾型IBV流行毒株的s1、M和N基因均存在不同程度变异,这可能是免疫鸡群肾型鸡传染性支气管炎长期流行的主要原因．     

Characterization of an avian infectious bronchitis virus isolated in China from chickens with nephritis

One IBV isolate, SC021202, was isolated from the kidneys of the infected young chickens by inoculating embryonated eggs, and its morphology, physiochemical and haemagglutonating properties were detected. Virulence of the isolate SC021202 was determined with specific pathogen-free (SPF) chicken inoculation. Nucleotide acid sequence of S1 gene of the isolate SC021202 was further sequenced and analysed. The physiochemical and morphological properties of the isolate SC021202 were in accordance to that of typical infectious bronchitis virus (IBV). In a pathogenicity experiment, the clinical signs and related gross lesions resembling those of field outbreak were reproduced and the virus isolate SC021202 was re-isolated from the kidneys of the infected chicken. Sequence data demonstrated that the full length of the amplified S1 gene of the isolate SC021202 was composed of 1931 nucleotides, coding a polypeptide of 543 amino acid residues. Compared with IBV strains from GenBank, the nucleotide and deduced amino acid sequence of S1 gene of the isolate SC021202 shared 60.0-91.4% and 49.1-88.9% identities, respectively. A nucleotide fragment of 'CTTTTTAATTATACTAACGGA' was inserted at nucleotide site 208 in the S1 gene of the isolate. These results indicated that IBV isolate SC021202 was a new variant IBV isolate and responsible for field outbreak of nephritis.     

2株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2株传染性支气管炎病毒分离株的S1基因进行序列扩增、测定及分析,应用DNAStar软件将这些分离毒株与中国常用疫苗毒株、其他血清型的代表参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。核苷酸与氨基酸序列分析结果均表明：2株分离毒株与J2、Q1、T3毒株的亲缘关系较近,与疫苗株H120和4/91的亲缘关系较远。