小麦STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计简并引物,以TcLr19、TcLr35和感病对照Thatcher的cDNA为模板进行抗病基因同源序列的PCR扩增,得到了6条通读的抗病基因同源序列(RGAs)Lr19-RGA1、Lr19-RGA2、Lr19-RGA3、Lr35-RGA1、Lr35-RGA2和TC-RGA.在NCBI中用BLASTp比对发现,Lr19-RGA1、Lr19-RGA2、Lr19-RGA3、Lr35-RGA1和Lr35-RGA2编码的氨基酸序列具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine-threonine kinase,STK)的催化结构域Ⅱ-Ⅷ.对序列分析还发现,它们与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小麦抗叶锈病相关基因提供了依据.     

烟草NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

通过同源克隆法获得烟草抗病基因同源序列(RGAs),为烟草抗病基因的筛选和相关研究提供帮助。基于抗病基因的NBS-LRR保守结构域,筛选并合成了3对简并引物,扩增烟草中的NBS-LRR类抗病基因。获得了4条与抗病基因具有高度同源性的NBS-LRR类烟草抗病基因同源序列(TRGA,登录号:MK634316,MK634317, MK634318, MK634319),目的片段大小均在500 bp左右;BLAST X分析表明,获得的4个烟草RGAs与已知RGAs具有高度相似性,氨基酸相似性为97%～100%;聚类分析将其分成2大类,包括TIRNBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两类抗病基因,其编码氨基酸序列含有NBS保守区的典型特征基序。通过简并引物进行同源扩增是分离烟草RGAs的有效方法,可为进一步抗病基因筛选及抗病分子育种奠定基础。     

东乡野生稻STK抗病基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的STK类抗病基因结构中的氨基酸保守区域,设计简并引物,对东乡野生稻STK类抗病基因片段进行克隆,得到一个733bp的cDNA序列,开放阅读框长度为594bp,可编码198个氨基酸,大小约为22kD,理论等电点为8.61。它与云南普通野生稻(AF510988、AY113701)的DNA序列的同源性较高,达98%以上。对其编码的氨基酸序列分析发现该序列属于STKc超家族成员,并具有ATP结合部位、活性部位和底物结合部位。     

小麦NBS类抗病相关基因片段RGA-A的初步研究

利用同源序列法分离小麦抗病相关基因同源序列。根据已经克隆的抗病基因保守结构NBS区设计引物,采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr24进行扩增。获得了一条通读的525 bp条带RGA-A,通过BLASTp比较,序列中含有典型的NBS保守结构域,与很多已知植物抗病基因的功能相应区域一致,编码的蛋白与大麦中抗性蛋白亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,RGA-A受叶锈菌诱导表达,表明该基因在小麦叶片中与抗叶锈性相关。该NBS类抗病基因相关片段的获得为研究小麦抗病基因奠定了基础。     

东乡野生稻NBS类抗病基因同源片段的克隆及序列分析

根据已知的NBS-LRR 类抗病基因结构中氨基酸的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR扩增及克隆,从东乡野生稻(Dongxiang Oryza rufipogon Griff.)中共获得7个新的NBS-LRR 类抗病基因同源片段.所有7 个抗病基因同源序列均含有NBS-LRR 类抗病基因的保守序列,如P-loop、...     

果蔗NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

为发掘果蔗抗病基因,促进果蔗抗病分子机制的研究,并为后续通过基因聚合分子育种提高果蔗品种的广谱抗性奠定基础,本研究根据已克隆的植物抗病基因保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR方法对抗病果蔗品种黔糖5号的RNA进行扩增,共获得7条果蔗富亮氨酸重复的核苷酸结合位点(nucleotide binding site-leucine rich repeat,NBS-LRR)类抗病基因同源序列。氨基酸序列比对分析结果表明,这7条果蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列均具有NBS典型结构域,且彼此间在氨基酸水平上表现出丰富的多态性。与7个已克隆的典型植物抗病基因同源序列构建系统进化树,7条果蔗抗病基因同源序列与基因RPM1和RPS2的亲缘关系较近,需进一步进行基因全长克隆和功能验证来确定含有这些片段的基因功能。     

棉花多抗品种中植棉KV-1抗病基因同源序列的克隆与分析

 许多抗病基因都具有核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复区（LRR）。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列,分别设计一对简并引物和一对特异引物,用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到10条NBS-LRR类RGAs。推导的氨基酸均具有抗病基因的P-loop（kinase-1a）、kinase-2、kinase-3a及GLPL区。同源性比较发现,其中1条属于TIR-NBS LRR类,其余9条属于non-TIR-NBS-LRR类。1条TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51%~60%,9条non-TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的RPS5、RPR1、Xa1等抗病基因的同源性为51%~60%。这些抗病基因同源序列（RGAs）可作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。     

斑茅cDNA中抗病基因同源序列的分离和表达特性分析

植物抗病基因具有一些特定的保守结构域。本研究根据已知植物同源抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗近缘植物斑茅的cDNA中扩增出6条抗病基因同源序列, 它们在NCBI上登录号分别为EU685835、EU685836、EU685837、EU685838、EU685839 和 EU685840。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因保守结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(Hydrophobic domain, HD)。氨基酸序列的同源性比对表明,6条RGAs序列同11条参试的抗病基因之间的同源性为8.3%~93%,而6条RGAs之间的氨基酸序列同源为30.5%~45.6%。另外,本实验所克隆的6条斑茅抗病基因同源序列中, kinase-2 (LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸,推测所克隆的NBS-LRR类抗病基因都属于non-TIR-NBS-LRR类。定量PCR分析表明, 6条斑茅抗病基因同源序列在根、茎和叶片中组成型表达,同时这些抗病基因同源序列的表达会受外源信号分子水杨酸和过氧化氢的上调作用,可能在斑茅的抗病性中具有一定的作用。     

三种野生稻候选抗病基因的克隆与分析

候选抗性基因克隆策略是克隆植物新抗性基因的重要途径.根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中的氨基酸保守区域,设计兼并引物,通过RT-PCR扩增、克隆和测序,从茶陵野生稻,东乡野生稻和小粒野生稻中共获得了11条NBS-LRR类抗病基因同源序列.通过聚类分析可将同源序列分为3类,其中茶陵野生稻中得到1类,东乡野生稻中得到2类,而小粒野生稻中得到3类.但是小粒野生稻包含有其他两种野生稻的序列.三类序列都与水稻抗病基因RPR1具有较高的同源性,有一类氨基酸序列同源性甚至高达88%,可能为其家族成员.利用电子定位将三类序列定位在水稻基因组11号染色体上RPR1附近.根据序列比对分析结果认为其中可能有1～2个新抗病基因.     

香蕉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从香蕉基因组DNA扩增出一条与植物抗病基因同源的序列,命名为BRGA1,该同源片段含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守性结构p-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域HD,它与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为23.8%-42.7%。Northern杂交表明BRGA1在香蕉中受水杨酸调控,属诱导型表达。     

小麦抗叶锈病基因Lr35的RGA分析

根据已知植物抗病基因的NBS,LRR等保守结构域设计引物,对小麦全套抗叶锈病近等基因系材料进行RGA分析。引物对Pto-kin1IN／XLRR-INV1从近等基因系TeLr35中扩增获得一条747bp的特异性片段。序列分析表明,该片段与小麦基因片段Triticum urartu clone BAC 210J24,Triticum monococcum DV92的BAC克隆231A16等具有较高同源性,为Lr35的克隆奠定了基础。     

黑麦重复序列在检测小麦品种中外源染色体的应用

本研究根据RAPD引物OPH20在黑麦中扩增出的特异序列pSc20H.2设计一对PCR引物pSc20ht-23/24,以来源于黑麦的小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr45及感病对照Thatcher为亲本进行PCR扩增。并对42个小麦抗叶锈近等基因系及103个小麦品种材料进行检测。引物pSc20ht23/24在TcLr45中扩增出一条约750bp的条带,而在Thatcher中无扩增条带。对该特异片段回收、克隆测序为734bp。42个小麦抗叶锈近等基因系检测在TcLr26中扩增出与TcLr45相同的条带,而在同样来源于黑麦的小麦抗叶锈近等基因系TcLr25中未扩增出该条带;中国春-Imperial黑麦附加系1R-7R中除5R外均扩增出该条带;13个1B/1R易位系小麦品种也扩增出该条带;90个地方小麦品种中有16个扩增出该条带,6个品种经系谱分析具有黑麦遗传背景,表明该标记可用于检测小麦中含有的除黑麦5R染色体之外的外源染色质。     

甜椒胞质雄性不育恢复系SRAP及SCAR标记

以甜椒胞质雄性不育恢复系5-2R1和相应的保持系5-2为试材,利用SRAP分子标记技术筛选与甜椒恢复基因相关的分子标记。128对SRAP引物共扩增获得了3796条从100bp至800bp大小不同的条带,平均每对引物组合可扩增出30条清晰的条带,检测到4个多态性位点,其中恢复系材料仅有1个。对该特异片段进行回收、克隆和测序,结果表明该片段全长为259bp。经数据库比对分析表明,该片段与线粒体中的NADH脱氢酶第5亚基(GenBank:EF151914.1)具有81%的同源性;同时,该片段与辣椒BAC克隆PEPBAC 158K24(GenBank:FJ597540.1)的部分序列高度同源。根据序列特点设计特异SCAR引物,对恢复系和保持系进行扩增验证,仅在恢复系中扩增出目的条带,表明已成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。我们推测本研究获得的SCAR标记可能与胞质雄性不育恢复性状连锁。     

转录调控基因GmLEC1的cDNA克隆及其植物表达载体的构建

以高油大豆中豆32 开花后30 d的种子为材料,根据已报道的拟南芥脂肪酸合成相关转录因子LEC1序列设计简并引物,采用同源序列法从大豆种子中分离了大小为850 bp的cDNA片段,测序结果表明,该片段与拟南芥中已克隆的脂肪酸合成基因高度同源,包含完整的读码框,采用酶切连接和gateway技术构建了该基因的超量表达和RNAi植物表达载体.为借助农杆菌介导法将LEC1基因转化到大豆再生植株中,对分离的LEC1基因进行功能验证,培育高油大豆新品种奠定了基础.     

小麦抗叶锈病基因Lr45的SSR分子标记

用定位于2A染色体的59对SSR、EST-SSR引物,对小麦抗叶锈病基因Lr45进行分子标记,共筛选出11对揭示TcLr45多态性的引物。用157株F₂抗感群体对这11对引物进一步检测,得到4个与Lr45共分离的SSR标记(Xgwm95、Xgwm47、Xgwm372和Xgwm122)。将经PAGE检测的标记Xgwm95的抗感差异带及Xgwm47的抗性片段进行克隆测序发现其中含有微卫星序列,且均为二核苷酸重复。Xgwm372和Xgwm122经琼脂糖凝胶电泳发现与Lr45的供体黑麦有共同的标记片段,可直接用于分子标记辅助选择。     

甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB中与MS2Bnap基因同源片段的克隆及序列分析

以甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB的可育株和不育株为材料, 提取减数分裂期与单核期的花粉mRNA, 反转录合成cDNA, 并以其为模板扩增花粉特异基因MS2Bnap. 结果减数分裂期能扩出产物, 而单核期无任何产物. 将减数分裂期的扩增产物克隆、测序. 同源性分析表明: 在S45AB上克隆的MS2Bnap基因与Gene Bank公布的拟南芥控     

TMV侵染烟草基因差异表达的cDNA-AFLP分析

以烤烟品种龙江925 [高抗烟草普通花叶病(TMV)]接种TMV的叶片为材料,选用240对引物组合的扩增, 获得约 9 500个转录基因片段, 经过克隆测序最终获得了12个诱导表达片段, 它们与核酸代谢、蛋白质合成与修饰、能量代谢、胁迫响应、细胞内运输、糖代谢等相关, 并利用荧光定量PCR分析一个诱导表达片段TIF2在0~72 h之间5个时间点(0、12、24、48和72 h)的基因差异表达, 证实了所获得的基因序列为真实诱导的表达序列。对此序列进行RACE, 最终获得全长cDNA序列, 全序列857 bp, 预测的编码区在101~613 bp之间, 共编码170个氨基酸。经Blastn、Blastp比对分析, 在烟草中没有获得其同源序列, 确定该基因是在烟草中发现的与抗TMV相关的新基因。     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

海南疣粒野生稻乙烯受体的保守序列分析

本研究用自行设计的乙烯受体(ERS)保守引物从海南疣粒野生稻基因组DNA中克隆获得长度为1454bp的乙烯受体基因片段，推测该片段由2个内含子和3个外显子组成，外显子总长为974bp，编码324个氨基酸。与栽培稻(O.sativa)乙烯受体基因基因组DNA(os DNA)可比对序列的相似性达81．84％，推导出其mRNA与栽培稻的乙烯受体基因cDNA(OsERS)相应片段的同源性高达95．59％，而与栽培稻(Oryza sativa subsp Indica)ERS2相应片段的同源性为71．05％。