禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

应用多重RT-PCR检测甘蔗黄叶病毒和高梁花叶病毒

建立了多重RT-PCR同时检测甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)和高梁花叶病毒病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的技术体系,该体系可有效地对甘蔗田间植株和试管苗进行检测.根据引物之问的互补性及引物的Tm值筛选多重PCR引物.确定适宜的PCR缓冲液的...     

分子标记技术在凡纳滨对虾中的应用进展

近年来,随着生物技术的迅猛发展,分子标记的应用越来越受到生物学家和育种家的重视。本文对DNA分子标记的种类及其特点进行了概述,并论述了目前DNA分子标记在凡纳滨对虾中的应用进展,同时对其应用前景进行了分析。     

凡纳滨对虾病毒病防控技术

对凡纳滨对虾病毒病的发生特点进行了总结并分析,针对病毒爆发的机制进行探讨,提出凡纳滨对虾病毒病防控技术,通过该技术可推迟病毒病的爆发时间,减少因病毒引起的死亡,提高养殖效益,提升对虾健康养殖技术水平.     

凡纳滨对虾营养需求研究

凡纳滨对虾是目前世界上养殖虾类产量最高的三大品种之一,是水产养殖中非常重要的物种.提高凡纳滨对虾的产量是水产养殖中的重要课题.综合现有关于凡纳滨对虾营养学的研究,从蛋白质、脂类、碳水化合物、微生物和矿物质几个方面出发,分析凡纳滨对虾生长的营养需求.对凡纳滨对虾营养需求的分析能够为改善和控制凡纳滨对虾的生长、提高营养物的消化利用率,从而进一步研究凡纳滨对虾生长所需的最佳营养素配比、构建营养更加均衡的饲料提供重要参考.     

二重实时荧光RT-PCR检测法在口蹄疫病毒检测中的应用

为探究二重实时荧光RT-PCR检测法在口蹄疫病毒检测中的应用情况,依照口蹄疫病毒(FMDV)聚合酶3D基因序列,规划并组合成引物与探针,有针对性的优化部分反应条件,构建了FMDV通用型与A型二重实时荧光RT-PCR检测法。选择124份疑似感染的试样进行检测。结果显示,构建的荧光RT-PCR方法在101~107拷贝/uL模板范围中形成良好的线性关系,对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒均呈现出阳性扩增信号,共计检测出FMDV-T阳性10份,FMDV-T/FMDV-A双阳性7份。可见,RT-PCR检测法能够定量分析及同时检测大量口蹄疫病毒样本。     

1株乳酸菌在凡纳滨对虾养殖中的应用效果

利用从对虾消化道分离出的1株乳酸菌优势菌株HN3,分别对哈维氏弧菌和副溶血弧菌进行体外拮抗实验,同时通过乳酸菌拌料投喂的方式开展凡纳滨对虾的养殖试验。结果表明:乳酸菌液及中和酸性后的胞外液均对2种弧菌有显著的抑制效果(P0.05);乳酸菌拌料投喂能显著提高对虾的养殖存活率、日增体质量和特定增长率(P0.05);对虾消化道和养殖水体中的乳酸菌和总细菌数量大幅增加,弧菌数量显著降低(P0.05),其中,以乳酸菌添加剂量4×106~5×106cfu·g-1的综合养殖效果最佳。此株乳酸菌适应对虾消化道的环境并能定植,对抑制对虾消化道弧菌数量、优化体内菌群组成和改善养殖环境有重要的作用。     

凡纳滨对虾室内生态育苗技术

介绍了凡纳滨对虾室内生态育苗技术,包括设施与材料、育苗车间消毒处理、育苗用水处理、无节幼体投放、培育管理、生物饵料培养、常见疾病的防治方法等方面内容。最后,对凡纳滨对虾室内生态育苗的关键技术进行了讨论。     

凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA在毕赤酵母菌中的表达

[目的]明确凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA(LvcrustinA)在毕赤酵母菌中的表达情况,为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础.[方法]采用全基因合成法(PAS)合成LvcrustinA基因,然后将LvcrustinA基因克隆至真核表达载体pYE-GAPα,所得重组质粒转化感受态细菌TOP10,以质粒提取试验盒提取的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转至毕赤酵母菌GS115;以SDS-PAGE电泳检测和Western blotting鉴定分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况,并通过保护试验验证融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌的抵抗作用.[结果]以构建的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转毕赤酵母菌GS115,获得的重组菌株在30℃下摇床(220 r/min)培养24 h即可获得融合蛋白LvcrustinA,且随培养时间的延长,其表达量逐渐增多.Western blotting鉴定结果显示,纯化的融合蛋白LvcrustinA能被抗His抗体识别.保护试验结果表明,融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌具有良好的抵抗力.[结论]利用表达质粒pYE-GAPα和酵母菌GS115可成功重组表达获得LvcrustinA,且获得的LvcrustinA具有促进凡纳滨对虾抵抗副溶血弧菌感染的作用.     

凡纳滨对虾体重校正系数研究

测量海南南疆生物有限公司板桥育苗基地2003年14个家系600只凡纳滨对虾不同月龄的体重;采用回归分析方法,并利用回归分析的显著性检验,建立了最优回归方程及凡纳滨对虾的生长曲线;根据最优化方程,以6月龄体重为标准制定了体重的校正系数表。校正系数表是由生产实践总结而来的,在制定该凡纳滨对虾育苗基地的育苗工作、生产计划以及进行不同生产组别和不同对虾的生产性能比较时,用以校正到可比水平,具有重要的实际应用价值。     

鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)3D基因序列,设计合成1对引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了DHV的RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该引物仅特异性扩增出DHV 460 bp的特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和鹅副粘病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法能检测到100 pg的DHV核酸;对6份临床病料进行RT-PCR扩增,DHV的检出率为83.33%(5/6)。结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床病料中的DHV进行快速检测。     

小苍兰3种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus (FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumubermosaic virus (CMV)和菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus (BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测小苍兰3种病毒的多重PCR检测体系.该体系能够一次扩增出FreMV,CMV和BYMV的特异片段,其大小分别是340、628和212 bp.测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达97％以上.灵敏度测定结果表明,从≥10-2mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒.     

文心兰3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测文心兰3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出CyMV、ORSV和BYMV的特异片段,其大小分别是551、325和212bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓皱缩病毒(SCV)和草莓镶脉病毒(SVBV)

[目的]通过对反应条件和参数的摸索与优化,建立多重RT-PCR检测方法,实现2种病毒的同时高效快速检测。[方法]通过CTAB法与试剂盒提取RNA,以优质的总RNA为模板,进行梯度PCR,结合扩增内标的检测体系,建立多重RT-PCR检测方法。[结果]建立了优化的SCV和SVBV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株进行快速稳定的病毒检测。[结论]该研究为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法,为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。     

三重RT-PCR快速检测多种马铃薯病毒的研究

依据马铃薯X病毒、S病毒、A病毒及卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录反应中dNTPs浓度、退火温度、PCR反应中Mg2+浓度、循环条件4方面优化三重RT-PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,分别得到620bp(PVX)、435 bp(PVS)、300 bp(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段.结果表明,反转录反应中dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+对整个反应的影响最大;其次是退火温度;循环条件对RT-PCR影响较小.优化的三重RT-PCR反应体系为马铃薯病毒的检测提供了一种快速、灵敏、简便的方法,对马铃薯病毒的早期检测和防治提供了有效手段.     

球根鸢尾3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的鸢尾轻花叶病毒(Iris mild mosaic virus,IMMV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测球根鸢尾3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出IMMV、NLV和BYMV的特异片段,其大小分别是770bp、266bp和186bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

双重RT-PCR法快速检测多种马铃薯病毒的研究

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。     

广西百色烟草主要病毒病种类鉴定

[目的]分析鉴定广西百色烟草主要病毒病种类。[方法]2006～2010年连续5年对百色市烤烟主产区697个烟草病毒样品和132份土壤样品及126份蚜虫（Myzus persicae）样品进行多重RT-PCR检测。[结果]在所有采集的烟草样品中多数能检测到烟草病毒的存在,检出率为99.0%;检出烟草花叶病毒（TMV）病样521个,检出率为74.8%;黄瓜花叶病毒（CMV）病样149个,检出率为21.4%;马铃薯Y病毒（PVN）检出率为37.7%,共263个。其中,TMV与CMV混合侵染的有56个,检出率为8.0%;TMV与PVY混合侵染的166个,检出率为23.8%;CMV与PVY混合侵染的有131个,检出率为18.8%;TMV、CMV和PVY共同侵染的有55个,检出率为7.9%。132份植烟土壤中均含有TMV病毒,检出率为100.0%,而PVY和CMV均未测出。126份蚜虫样品中,12份蚜虫中检测出只有PVY存在7,份蚜虫中只有CMV存在7,7份蚜虫中同时存在PVY和CMV。[结论]危害百色烟草病毒主要为TMV、PVY和CMV,其中TMV初侵染源为土壤中存在的TMV病毒,而PVY和CMV的初侵染源主要为迁入的带毒蚜虫。     

利用RT-PCR检测黄瓜上的西瓜花叶病毒

根据西瓜花叶病毒2号(WMV-2)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,含WMV-2外壳蛋白基因的质粒DNA为阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增。结果从感病组织中扩增出与预期的382 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。对2002和2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了同样的RT-PCR检测,结果表明98份材料中77．55％检测到WMV-2。     

基于多重RT-PCR技术检测新疆甜瓜主栽区3种病毒病及其分布

采用同源克隆的方法,从新疆感染病毒病的甜瓜中克隆获得WMV、CMV、ZYMV 3种病毒CP蛋白基因的部分片段。并基于单重RT-PCR扩增条件,采用单因素分析法,优化所获得多重RT-PCR的反应体系,利用多重PT-PCR体系对48份供试样品检测。结果表明,多重RT-PCR的检测结果与单重RT-PCR结果一致,说明构建的多重RT-PCR体系具有一定准确性和稳定性,可以用于WMV、CMV、ZYMV 3种病毒的快速检测、病源鉴定、阳性筛选等研究。通过分析甜瓜主要种植区病毒病的多重RT-PCR检测结果,初步得出新疆甜瓜主栽区3种病毒的分布现状与侵染形式,从而为病毒病的防治工作提供依据,以期对新疆瓜果生产中病毒防治,田间检测,流行病学调查以及抗病毒病甜瓜育种等研究提供相应的理论基础与依据。