瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

大豆细菌性斑点病菌hrpZPsg12基因增强病原菌对大豆的致病性并引起烟草过敏性反应

[目的]明确hrpZPsg12基因对大豆细菌性斑点病菌致病性的影响。[方法]采用PCR方法从大豆细菌性斑点病菌中克隆hrpZPsg12基因,利用具有自杀特性的敲除质粒pKNOCK-Cm和具有功能互补作用的粘粒pUFR034,构建了hrpZPsg12基因的突变载体pKNOCK477-7和互补载体pUFR1026-68,并筛选出hrpZPsg12基因的突变体477-1及其功能互补子1026-5。进一步将野生型Psg12、突变体477-1和互补子反应斑。但是,反应斑的大小有差异,Psg12菌株接种的病斑较大,477-1的较小,互补子1026-5的接近野生型菌株Psg12。病斑中细菌繁殖量分析表明,野生型菌株Psg12繁殖量最高,突变体477-1的最低,互补子1026-5的接近野生型菌株Psg12的繁殖量。[结论]hrpZ-Psg12基因能够增强大豆细菌性斑点病菌对大豆的致病性,并且能够在烟草上产生过敏性反应。     

棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能验证及致病成因分析

为分析棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能,利用基因同源重组原理将强致病力落叶型大丽轮枝菌Vd991菌株的VdTri15基因进行敲除。以Vd991菌株为对照,比较分析敲除突变体与野生型之间在生长速度、外分泌毒素、致病性等方面的差异,探讨VdTri15基因在致病过程中的功能。结果表明,VdTri15突变并不影响病菌的生长,但可引起其致病力减弱,分泌毒素种类发生改变。由此说明,VdTri15基因通过影响相关毒素的合成来影响大丽轮枝菌的致病力。     

灰葡萄孢PKA编码基因在病菌生长发育和致病过程中的功能

为明确灰葡萄孢cAMP信号途径中蛋白激酶A的催化亚基基因pka1、pka2和调节亚基基因pkaR在病菌生长、发育和致病过程中的功能,本研究构建了灰葡萄孢pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体,以野生型菌株BC22为对照,对pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体的表型和致病力进行分析,发现pka1基因的RNAi突变体的生长速率明显减慢、菌丝细胞变短、分生孢子产量增加、致病力减弱,菌落颜色、形态以及穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pka2基因RNAi突变体的菌丝较野生型明显变细,分生孢子产量降低,生长速率、致病力和穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pkaR基因RNAi突变体的菌丝变细,生长速率减慢,分生孢子产量降低,致病力减弱,穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别。结果表明:灰葡萄孢pka1基因正调控病菌的生长、菌丝发育和致病力,负调控分生孢子的形成;pka2基因正调控病菌的菌丝发育和分生孢子的形成;pkaR基因正调控病菌的生长、菌丝发育、分生孢子的形成和病菌的致病力。     

甘蓝黑腐病菌XC3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC₃374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC₃374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC₃374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC₃374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC₃374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

澳大利亚棉花黄萎病菌致病性鉴定研究

 在温室人工接种鉴定了澳大利亚16个棉花种植地区30个棉花黄萎病菌株的致病性.结果表明:根据人工接种5个棉花品种的抗感反应和病情指数,30个供试菌株划分为4种致病类型.致病类型I(3个菌株)具有较强的致病能力,致病类型Ⅳ(5个菌株)的致病能力较弱.致病类型Ⅱ(12个菌株)和致病类型Ⅲ(10个菌株)的致病能力中等,为澳大利亚棉花种植地区的主要菌系类型.     

生牛乳中高黏液型肺炎克雷伯菌耐药、毒力及生物被膜形成能力分析

【目的】评估分离自生牛乳及其环境中高黏液型肺炎克雷伯菌（hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae,hmKP）的生物被膜形成能力及耐药毒力风险,对其可能引起的潜在风险提出警示,进而为肺炎克雷伯菌（KP）的科学防治提供理论参考。【方法】采用药敏纸片法鉴定32株hmKP产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型,以半定量结晶紫法检测其生物被膜形成能力,并通过PCR对hmKP携带的耐药基因和毒力基因进行检测分析。【结果】从32株hmKP中共鉴定出ESBLs阴性菌株（non-ESBLs-KP）24株（占75.00%）、ESBLs阳性菌株（ESBLs-KP）8株（占25.00%）,均可形成生物被膜,其中,10株具有强生物被膜形成能力,17株具有中等生物被膜形成能力,5株表现为弱生物被膜形成能力。在10株具有强生物被膜形成能力的hm KP中有7株来自生牛乳样本,且ESBLs-KP中具有强生物被膜形成能力的菌株检出率（37.50%）高于non-ESBLs-KP中的检出率（29.17%）。所有hmKP至少携带4种以上的耐药基因,其耐药风险排序依次为四环素类=氨基糖苷类&g...     

河北省小麦叶锈菌群体毒性基因组成分析

将Browder和Wolfe分别提出的两种毒力频率法的原理结合起来研究1991年河北省小麦叶锈菌群体毒性基因及其组合的频率,以反映其相应的抗性基因及其组合的可用性。结果表明:V_(2d),V_a 等10个毒性基因的相对频率在56.58%以上,是优势毒性基因;V_(2c),V_(24)等5个毒性基因的相对频率在7.92%以下,属稀少基因,V_1,V_(2a)等14个毒性基因的相对频率为12.07%～44.75%,介于以上二者之间。在7个与目前生产有密切关系的优势毒性基因中,以V_(3B?,10,17,23,26),V_(3B?,10,14ab,17,23,26),和V_(1,?Bg,10,14ab,17,23,26)为优势组合,达14.04%以上。在不同毒性基因组合中,出现频率较高的有V_(3B?,26),V_(?B?,10,26),V_(3Bg,10,23,36),V_(3Bg,10,17,23,26),和V_(?B?,10,14ab,17,23,26),其频率分别为89.47%,71.93%,61.40%,55.26%和34.21%,说明其相应的抗性基因组合的联合抗病性差,不宜在生产上同时利用。     

传染性支气管炎病毒M_(41)株种子批的建立

[目的]为生产鸡传染性支气管炎疫苗奠定基础。[方法]在研究制备鸡传染性支气管炎疫苗所用毒种的毒力、免疫原性、保存期等的基础上,测定4种来源的传染性支气管炎病毒M41株的50%鸡胚感染量(EID50),选取滴度较高病毒作为毒种,建立传染性支气管炎病毒M41株种子批,并测定其毒力。[结果]含毒尿囊液在冻干前后对鸡胚的毒力不变。毒力试验结果表明该毒的毒力中等,可为雏鸡提供保护。M41株种毒的EID50和免疫原性在7代内无变化。湿毒在-15℃保存半年以内,其毒价基本不变。种子批建立后未受到细菌及其他微生物的污染。[结论]该种子批可以用于生产鸡传染性支气管炎疫苗。     

Xoryp_08180 of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Encoding a Hypothetical Protein,is Regulated by HrpG and HrpX and Required for Full Virulence in Rice

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc) causes a destructive bacterial leaf streak disease in rice. Some of the gene products annotated as hypothetical proteins in the genome of Xoc may contribute to its virulence in rice. A mutant, Mxoc1679, screened from our previous Tn5-tagged mutant library for Xoc strain RS105, showed reduced virulence in rice. In this mutant, a gene named as Xoryp_08180 was disrupted by Tn5 insertion. Xoryp_08180 encodes a 1 306-aa hypothetical protein which is highly conserved in Xanthomonas spp. Non-polar mutation of Xoryp_08180 in RS105 strain led to a significant reduction in bacterial virulence and growth in rice, a delayed hypersensitive response (HR) in non-host tobacco, and a decrease in extracellular protease activity. The deficiencies above were restored to wild-type level in the complementary strain by expressing Xoryp_08180 in trans. In addition, the expression of Xoryp_08180 was repressed in hrpG and hrpX mutants in planta but not in a nutrient-rich condition. These results suggested that Xoryp_08180 is a virulence factor required for extracellular protease production, HR induction and full virulence of Xoc.     

吉林省大豆新品种(系)大豆花叶病毒病抗性分析

通过2003～2005年对吉林省大豆新品种(系)大豆花叶病毒病的抗性鉴定,初步明确,吉林省新育成的大豆品种和后备材料较抗大豆花叶病毒病。在5个不同生态区内,新品种(系)抗大豆花叶病毒病的水平由高到低排序:四平地区>长春地区>吉林和白城地区>通化地区。前两个地区抗源丰富。品种抗性以抗弱毒株系为主,抗中毒株系居中,感强毒株系比例较低。表明吉林省目前流行的病毒株系仍然是弱毒株系,伴随一定程度的中毒株系。     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。     

速杀威对两种蚜虫、麦圆蜘蛛毒力初筛选和对小绿叶蝉LC_(50)测定

速杀威是由四川成都宏威制药有限公司研制的一种植物性杀虫剂．低浓度５０ｐｐｍ 的速杀威对萝卜蚜（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｂｒａｓｓｉｃａｅ）的毒力为９３．０２％，与克 敌乐尔１０８ｐｐｍ以及乐果２００ｐｐｍ的毒力相当．当速杀成浓度为１００ｐｐｍ时，其毒力 高于乐果２００ｐｐｍ，而与克敌乐尔２７０ｐｐｍ相当。速杀威ｌ００ｐｐｍ对茶二叉蚜（Ｔｏｘｏ ｐｔｅｒａ　ａｕｒａｎｔｉｉ）的毒力与乐果２００ｐｐｍ以及克敌乐尔２７０ｐｐｍ相似。速杀威１００ｐｐｍ 对麦圆蜘蛛（Ｐｅｎｔｈａｌｅｕｓ　ｍａｊｏｒ）的毒力与乐果２６６ｐｐｍ相当。速杀威对小绿叶蝉 （Ｅｍｐｏａｓｃ　ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）的ＬＣ５０值为２．１４±０.６８２５ｐｐｍ，低于克敌乐尔的ＬＣ５０３．３１ ±０．１５８６ｐｐｍ和乐果的ＬＣ５０４． ２７± ０． ５６５ｐｐｍ值．     

不同培养基继代培养球孢白僵菌对西花蓟马毒力和产孢量的影响

【目的】通过开展连续继代培养对高毒菌株产孢和毒力的影响研究,获得对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力和产孢量均高且稳定的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株,进一步提出有效防止菌株退化、优良菌株保存和改良的方法与措施,为高效菌株的规模化生产提供参考。【方法】室内条件下,采用浸虫法,用浓度为1×107个孢子/mL球孢白僵菌悬浮液处理西花蓟马初羽化成虫,分别测定28株不同来源的菌株对西花蓟马的毒力;并将筛选出的4株高毒力菌株的分生孢子分别涂布于玉米琼脂（CMA）培养基与SDAY培养基上,比较不同菌株以及不同培养基之间产孢量的差异,筛选出高产孢菌株与产孢培养基,以筛选得到的白僵菌菌株为初始菌株F0,把F0代球孢白僵菌分别接种于CMA培养基、添加蝉蜕的CMA培养基和添加西花蓟马虫尸粉的CMA培养基,分别测定经过不同培养基连续5代继代培养得到的球孢白僵菌对西花蓟马成虫的毒力,并测定产孢量。使用模型模拟分析球孢白僵菌菌株经过不同培养基继代培养后培养代数与产孢量的关系,并对不同培养基培养得到的不同培养代数的白僵菌菌株的产孢量与其对西花蓟马的致死中时（LT₅₀）进行回归分析,研究毒力与产孢量的相关关系。【结果】经过室内毒力测定,处理5 d后,菌株DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8、SZ-26对西花蓟马成虫的校正累积死亡率均高于90%,LT₅₀均在3 d内,毒力显著高于其他菌株;比较高毒力菌株在两种产孢培养基上的产孢量,发现4株球孢白僵菌的产孢量存在显著差异,菌株DZDC-9的产孢量显著高于其他3株,4株菌株在CMA培养基中的产孢量均明显高于SDAY培养基。随着白僵菌菌株在CMA培养基上连续5代的继代培养,菌株对西花蓟马成虫的致病力呈现下降趋势,从第3代开始致病力显著降低,而添加蝉蜕的CMA培养基培养得到的不同培养代数的分生孢子对西花蓟马致病力则没有显著差异,添加西花蓟马虫尸粉的CMA 培养基培养得到的不同代数的分生孢子对西花蓟马致病力有一定的增强趋势;通过模型可以发现单纯以CMA培养基继代培养白僵菌的产孢量随培养代数呈现指数下降,而在培养基中添加蝉蜕或西花蓟马虫尸粉白僵菌产孢量则随培养代数呈现指数上升,蝉蜕或西花蓟马虫尸粉的添加对产孢量有一定的增强作用。白僵菌菌株产孢量与毒力存在一定正相关关系,产孢量相对较高的菌株对西花蓟马成虫的致病力相对较高,致死中时短。【结论】筛选得到一株对西花蓟马高效的白僵菌菌株DZDC-9,产孢培养基中加入蝉蜕和西花蓟马虫尸可以维持菌株生长特性,延缓毒力退化趋势;同一菌株的产孢量可以作为菌株毒力评价的一个指标。     

四川、山东小麦叶锈菌毒性与DNA多态性分析

本研究利用SSR标记对来自四川和山东两省的60个小麦叶锈菌株进行DNA多态性分析,同时利用小麦抗叶锈近等(单)基因系和已知所含抗叶锈基因的品系对这些菌株进行毒性分析。结果表明,菌株间相似系数较高且差异不大,为0.78～1.00,表明小麦叶锈菌所含毒性基因差异不大,菌株间亲缘关系较近。两省间/内小麦叶锈菌株的DNA多态性和毒性多态性丰富。小麦叶锈菌株的地理来源与毒性多态性有一定的相关性,而其地理来源、毒性多态性与DNA多态性不存在相关性。相同致病类型存在毒性差异,同一致病类型内遗传多态性丰富。