鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

[目的]用大肠杆菌表达出CIAV的衣壳蛋白(VP1)作为免疫抗原,以建立鸡传染性贫血病毒(CIAV)的血清学诊断方法.[方法]根据已发表的CIAV的衣壳蛋白(VP1)序列,结合Protean软件预测出抗原富集区域,设计并合成1对引物,利用PCR扩增该区域基因,将扩增成功的VP1基因片段经T4连接酶连接至PGEX-6P-1表达载体.连接成功的重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株,通过IPTG诱导进行原核表达,筛选出表达量最高的菌株及最佳诱导时间和1PTG诱导浓度.以感染CIAV的鸡阳性血清为一抗,对重组蛋白GST-VP1进行Western-blot分析.[结果]成功获得了重组质粒PGEX-VP1,诱导表达后经SDS-PAGE和Western-blot分析,分子量约71kD的融合蛋白GST-VP1在大肠杆菌Rosseta中以包涵体形式大量表达,并能与鸡传染性贫血病毒阳性血清发生反应.[结论]该研究可为抗CIAV单克隆抗体的制备及血清学诊断方法的建立等研究奠定基础.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的PCR扩增和克隆

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）衣壳蛋白基因（１．４ｋｂ），并将此基因克隆进ｐＵＣ－１８载体中。通过原位杂交、酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及其标记成探针对ＣＡＶ基因组的特异性反应等试验证实所获得的克隆是含有ＣＡＶ衣壳蛋白基因的重组质粒克隆。此工作为下一步ＣＡＶ衣壳蛋白体外表达的研究奠定了基础     

PRRS病毒核衣壳蛋白基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物，用RT—PCR扩增出美洲型PRRSV的核衣完蛋白(N)基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，再亚克隆到表达载体pGEX—6p—1谷既甘肽—S—转移酶(GST)基因的下游。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG于37℃条件下诱导，经SDS—PAGE和Western blotting分析，GST—N融合蛋白的分子质量约为39．5ku，另3种不同大小的GST—N降解产物，分子质量分别为33．0、30．5和27．5ku，其中39．5和30．5ku的降解产物分别占菌体蛋白的30．9％和15．3％。结果表明：PRRSV核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中以GST融合蛋白的形式得到高效表达，且表达产物能与PRRSV抗体阳性的猪血清发生特异性反应，可作为PRRS诊断抗原。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的PCR扩增和克隆

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）衣壳蛋白基因（１，４ｋｂ），并将此基因克隆进ＰＵＣ－１８载体中。通过原位杂交、酶切分析、Ｓdisplay statusdisplay status     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达

根据GenBank上公布的鸡传染性贫血病毒VP1的基因序列设计一系列引物,通过基因扩增得到了鸡传染性贫血病毒(CAV)VP1基因的全长片段和一系列不同N末端截断的VP1基因片段,分别将这些片段插入表达质粒载体pET28a的多克隆位点上,构建成4种重组表达工程菌(E.coli BL21/pET-28-CAVVP1、E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137),研究了4种不同长度VP1片段在重组大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE电泳筛选最佳表达方式。结果表明:E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表达分子质量为44ku的可溶性蛋白,E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表达分子质量为40ku的不可溶性蛋白,而在E.coli BL21/pET-28-CAV VP1和E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137的诱导表达产物中未见明显的表达蛋白出现。其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白将有可能用于研制CAV诊断抗原和亚单位疫苗研究。     

一株貉源犬瘟热病毒核衣壳蛋白的原核表达

根据GenBank中犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成1对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出约1600bp的片段,将此片段克隆于pMD18-Tsimple载体。经测序分析表明,与其它毒株N基因序列的同源性很高。再将其定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHTa中,转化感受态E.coli BL21细胞,经IPTG诱导表达分子量约63Ku的重组N蛋白。     

兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达

为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达和鉴定

[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap.     

水泡性口炎病毒2种血清型核衣壳蛋白的原核表达及生物信息学分析

用RT-PCR方法从水泡性口炎病毒(vsv)扩增印第安纳(Indiana)和新泽西(New Jersey)血清型核蛋白N基因,分别克隆至pMD20-T载体进行序列鉴定及生物信息学分析.构建重组表达质粒VSV-IN-pBCX和VSV-NJ-pB-CX,并经SDS-PAGE和Western-blot鉴定表明2种血清型病毒核衣壳蛋白N基因在BL21(DE3)宿主菌中成功表达,重组蛋白相对分子质量约为82 000,并能够与各自对应血清型阳性血清反应.这表明2个重组蛋白具有良好的抗原性,可作为用于建立水泡性口炎血清学诊断方法的诊断抗原.     

利用原核表达的衣壳蛋白制备马铃薯x病毒的抗血清

本研究构建了含马铃薯x病毒（pvx）衣壳蛋白（cp）基因的原核表达载体,利用在大肠杆菌内表达的马铃薯x病毒cp制备了效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带pvx情况的检测。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达

[目的]检测猪圆环病毒2型（PCV2）核衣壳蛋白（Cap）的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因（Cap）设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达载体质粒pET28a（＋）中,获得重组质粒pCAP-PCV2,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。[结果]序列测定表明,所克隆的序列大小为579 bp,与DQ104422的Cap基因序列一致;通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析证明,携带重组质粒pET-PCV2-Cap的大肠杆菌可以表达可溶性的衣壳蛋白。[结论]PCV2衣壳蛋白能通过表达载体质粒pET28a（＋）进行可溶性表达。     

O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定

为构建并表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的空衣壳蛋白的重组杆状病毒并鉴定其抗原性.以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFast-BacDual PH启动子下,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,并转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.增殖重组杆状病毒然后用其感染Sf9细胞,最后通过间接免疫荧光检测外源蛋白的表达.结果表明,表达产物能够被O型FMDV VP1多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功.该研究为进一步研究O型FMDV空表壳的体外组装提供前期实验材料,并为后期研制出口蹄疫的基因工程亚单位疫苗奠定基础.     

口蹄疫病毒A型AF/72株衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

通过限制性酶切位点将P12A和3C基因插入到带有双启动子(Pp10和PPH)的杆状病毒表达载体p Fast BacTMDual,转化E.coli DH10感受态细胞进行蓝白斑筛选,将鉴定正确的重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒r Bac-Dual-P12A3C,通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹(Western-blot)检测衣壳蛋白的表达。IFA结果表明表达产物能够被A型FMDV猪抗阳性血清所识别,鉴定正确并具有良好反应原性。Western-blot检测到81 k D(P12A)、57 k D(VP0+VP3)、47 k D(VP3+VP1)、33 k D(VP0)和24 k D(VP1/VP3)5条蛋白条带,与预期相符。该研究为进一步研究A型口蹄疫病毒空衣壳的体外组装提供了试验依据。     

鸡传染性贫血病毒分子生物学研究进展

对国内外鸡传染性贫血病毒基因组及其编码蛋白等方面的最新研究成果进行了论述。     

猪瘟兔化弱毒株Erns基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。     

鸡骨保护素（chOPG）的原核表达、纯化及抗体制备

【目的】骨保护素（OPG）是一种新发现能抑制前体破骨细胞分化及成熟破骨细胞活性的蛋白,本文旨在从体外扩增、表达鸡骨保护素（chOPG）蛋白,并制备其多克隆抗体,为深入研究它的生物学功能奠定基础。【方法】以体外培养的鸡胚成骨细胞中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出chOPG基因,测序后克隆至原核表达载体pET-32a（+）,成功构建了原核表达质粒pET-32a（+）-OPG,重组质粒转化Rosetta-gami（DE3）pLysS,经IPTG诱导表达。【结果】表达产物经SDS-PAGE电泳,发现目的蛋白大小约为63 kD,占菌体总蛋白的11.9%,Western blotting分析显示,表达的chOPG蛋白具有良好的免疫反应性。用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的蛋白,以纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价达到1﹕10240。Western印迹结果表明,该抗体可以和chOPG酵母表达产物特异性结合。【结论】成功地实现了鸡骨保护素在大肠杆菌中的表达,并获得其多克隆抗体。     

香蕉条斑病毒CP区基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

依据锌指结构在BSVCP上的可能位置合成了2条引物,通过PCR扩增得到长约640 bp的目的片段;将目的片段与质粒pET28 b(+)连接,构建了含BSVCP区基因的融合蛋白原核表达载体pET28b-BSVCP;克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),并诱导表达;经IPTG诱导后,出现一特异的约30 kDa融合蛋白质表达条带。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

大麦黄矮病毒GAV株系通读蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶ）ＧＡＶ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ护增获得通读蛋白（readthrough protein RTP)基因的目的版段,将其重组到pGEM-7zf( )并转化ＪＭ１０９利到了含有完整ＲＴＰ基因的重组子,采用又脱氧终上法进行序列分析。结果表明,ＲＴＰ基因为１３３７nt,与文献报道的血清学较密切的ＢＹＤＶ ＭＡＶ－ＰＳ１相比,核苷酸和氨其酸的同源性分别为８７．４％和８７．１％。将些ＲＴＰ基因克隆到原核表达质粒pET-5a上,在大肠植菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中用ＩＰＴＧ旅导表达,利用 分离包含体的方法结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳,利到了纯化的分子是为６６ku的非融合蛋白。