紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族鉴定与干旱胁迫下的表达分析

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族是最大的转录因子家族之一，R2R3-MYB亚家族在植物胁迫响应、次级代谢、生长和发育等过程发挥重要作用。本研究利用紫花苜蓿(Medicago sativa‘Zhongmu No.1’)基因组和转录组数据，通过生物信息学方法鉴定了R2R3-MYB转录因子，并对其序列特征、系统进化、染色体分布、基因结构、顺式作用元件及干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果显示，紫花苜蓿中有121个R2R3-MYB亚家族成员，各成员均具有两个典型的MYB结构域，理化性质变化较大。系统进化分析将121个成员分为33个组，各成员无规律地定位在8条染色体上。基因结构和顺式作用元件分析发现，同一分组具有相同或相似的外显子数和顺式作用元件。响应干旱胁迫表达模式分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明干旱胁迫下MsMYB12,MsMYB45,MsMYB52,MsMYB73,MsMYB88,MsMYB124,MsMYB149,MsMYB189,MsMYB268基因的表达量显著上调，可作为后期紫花苜蓿响应干...     

紫花苜蓿MsMYB58基因克隆及抗旱功能鉴定

干旱是限制紫花苜蓿(Medicago sativa)生长的重要环境限制因子，MYB转录因子广泛参与调控植物的生长发育和非生物胁迫。本研究对紫花苜蓿MsMYB58基因进行克隆及生物信息学分析，初步解析紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能。结果显示，MsMYB58开放阅读框全长1 002 bp,编码蛋白含有333个氨基酸，分子量为37.80 kDa,属于典型的R2R3-MYB家族成员，定位在细胞核、细胞壁和细胞膜中。MsMYB58的组织特异性表达主要在茎中，在根中的表达最少；在脱落酸、盐和自然干旱处理中，MsMYB58的表达水平呈现不同的变化趋势。干旱胁迫下，过表达MsMYB58的转基因烟草的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性和脯氨酸含量显著增加，而丙二醛的含量则显著下降，叶绿素荧光参数PSⅡ利用效率和PSⅡ最大光化学量子产量显著升高，非光化学猝灭显著下降。本研究初步探究了紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能，为进一步挖掘紫花苜蓿干旱响应功能基因提供理论基础。     

蒺藜苜蓿MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析

植物中MYB转录因子数量众多,功能多样,在植物生长发育、逆境响应等多方面发挥着重要作用。为研究MYB转录因子在蒺藜苜蓿中的功能,本研究采用PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtMYB16基因,该基因开放阅读框1074 bp,共编码357个氨基酸。进化树分析结果显示,MtMYB16蛋白与白花草木樨中MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,MtMYB16蛋白定位在细胞核中。酵母自激活检测结果显示,MtMYB16蛋白具有自激活活性,自激活结构域位于C端。表达分析结果显示,MtMYB16在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实中均有表达,在根中表达水平最高;IAA、MeJA能够降低MtMYB16表达水平;盐胁迫和干旱胁迫下,MtMYB16表达量在1.0 h时迅速增加,说明MtMYB16可能具有响应盐及干旱胁迫的功能。     

日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子，参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因，并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽，具有疏水性，系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示，该基因在幼嫩叶片中大量表达，随植物发育表达量逐渐减少，但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

MsWRKY33转录调控MsACS2影响紫花苜蓿耐盐性的研究

乙烯作为重要的植物激素之一,在植物逆境胁迫应答中发挥重要作用。ACS基因是乙烯合成过程中的关键限速酶(ACC合成酶)基因,本研究通过探究紫花苜蓿MsWRKY33转录因子对ACS基因的调控关系,为MsWRKY33参与紫花苜蓿耐盐胁迫响应的具体调控机制奠定理论基础。利用同源克隆、载体构建、酵母单杂交、酵母双杂交、qRT-PCR等技术,验证MsWRKY33对AtACS2和MsACS2的转录调控,并对盐胁迫下转基因株系中MsACS2表达模式进行分析。结果显示：MsWRKY33转录因子可以与W-box元件特异性结合,且对AtACS2和MsACS2具有转录调控作用;MsWRKY33转基因株系中MsWRKY33基因的表达量显著高于对照,转基因株系中MsACS2的表达是在MsWRKY33基因大量表达后呈上升趋势,进一步说明紫花苜蓿MsACS2基因的表达可能受MsWRKY33转录因子的正向调控。因此,紫花苜蓿受到盐胁迫时可诱导MsWRKY33的表达,MsWRKY33转录因子通过正向调控MsACS2表达,可能影响乙烯合成,从而影响紫花苜蓿的盐胁迫响应。     

紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的分离及遗传转化研究

WRKY转录因子是植物特有的转录因子,广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中WRKY转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个WRKY I类转录因子MsWRKY33。该基因CDS全长1536 bp,编码512个氨基酸,结构分析显示MsWRKY33包括两个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H),表明其属于WRKY I 族WRKY转录因子。亚细胞定位预测MsWRKY33蛋白定位在细胞核。MsWRKY33基因受盐、干旱和冷胁迫诱导,暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体pET-MsWRKY33, SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达了MsWRKY33蛋白。扩增MsWRKY33编码区cDNA,以pBI121为基础载体,构建植物超表达载体pBI121-MsWRKY33。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。qRT-PCR检测发现,MsWRKY33基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索WRKY转录因子基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

日本结缕草ZjHY5的克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

转录因子LONG HYPOCOTYL 5(HY5)在光诱导基因表达中起中心调控因子的作用。为了探究日本结缕草(Zoysia japonica)中ZjHY5基因的亚细胞定位及自激活特性,本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆得到ZjHY5基因。该基因开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸残基。ZjHY5蛋白无信号肽,进化树分析显示其与漆姑草(Sagina japonica)及苜蓿(Medicago sativa)中HY5蛋白的相似度最高。亚细胞定位结果显示,ZjHY5定位于细胞核中。通过构建酵母诱饵载体,并对其进行自激活检测,结果显示,ZjHY5基因无自激活活性,可用于后续试验。本试验为深入研究日本结缕草ZjHY5基因的功能奠定了基础。     

蒙农杂种冰草AcdMYB1基因克隆及表达分析

‘蒙农杂种’冰草(Agropyron cristatum×A.desertorum‘Hycrest-Mengnong’)具有干草产量高，适口性好，抗逆性强的特点，是中国北方干旱地区建立人工草地的适宜草种。本研究利用同源克隆方法从‘蒙农杂种’冰草中克隆得到的1个MYB类转录因子基因(命名为AcdMYB1),对其进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明：该基因cDNA序列长度为1 161 bp,包含完整开放阅读框(ORF)为969 bp,编码322个氨基酸，具有MYB转录因子的保守结构域。AcdMYB1与小麦族的山羊草、普通小麦、野生二粒小麦的同类基因亲缘关系最近，序列一致性均在90%以上。组织表达中AcdMYB1基因在穗中的表达量最高，其次为叶、根，茎中表达量最低；在模拟自然干旱胁迫下，能够显著降低AcdMYB1的表达水平。烟草亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞核。本研究为进一步探索‘蒙农杂种’冰草AcdMYB1基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化

为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链。通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2。通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株。     

紫花苜蓿响应低温胁迫转录因子的鉴定及表达分析

研究证明,转录因子广泛参与植物的生长发育过程并响应多种生物/非生物胁迫信号途径。低温胁迫可导致紫花苜蓿(Medicao sativa)减产、越冬率降低以及生产年限缩短。利用新一代高通量转录组测序技术,本研究对4℃低温胁迫下紫花苜蓿中响应低温胁迫的转录因子基因进行了鉴定,并对其表达情况进行分析,结果表明,转录组测序共获得78 925条Unigene序列和3 448个差异表达基因。其中,从3 448个差异表达基因中共鉴定出43个转录因子家族,共251个基因被显著地诱导表达。不同转录因子家族基因受低温胁迫诱导表达不同。本研究有助于在整体水平加深了解紫花苜蓿转录因子表达特性,为进一步研究这些响应低温胁迫的转录因子的功能提供参考。     

白三叶TrMYB1R1全长克隆及转录表达分析

R1-MYB是MYB转录因子家族中的一亚类,可能参与植物非生物胁迫应答。通过RT-PCR和RACE技术,在白三叶(Trifolium repens)中成功克隆出一个MYB转录因子TrMYB1R1,基因全长1 403 bp,编码297个氨基酸残基。通过生物信息学分析,发现TrMYB1R1蛋白含有一个MYB结构域,属于MYB-related蛋白,保守域形成3个α-螺旋;亚细胞定位预测该蛋白可能位于细胞核中。同源进化分析结果显示TrMYB1R1蛋白和豆科植物MYB蛋白亲缘较近,蛋白进化符合植物进化分类。非生物胁迫和外源激素处理结果表明,该基因在白三叶根和叶中均受到诱导调节。在聚乙二醇(PEG)水分胁迫、镉胁迫、4℃冷处理及35℃高温处理下,白三叶TrMYB1R1表达受到抑制,且该基因对镉、冷及热处理响应强烈,对PEG处理响应较弱;而在NaCl胁迫处理下该基因受到诱导表达;同时,脱落酸(ABA)处理前期抑制TrMYB1R1表达,但细胞分裂素(CTK)显著诱导该基因表达。这些结果表明,该基因可能参与多种非生物胁迫应答并可能受激素调控,但对TrMYB1R1在白三叶中的功能及调控作用仍需进一步研究。     

紫花苜蓿耐盐性相关NAC转录因子的挖掘及表达分析

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)是植物特有的一类转录因子家族,可调控植物响应盐胁迫。本研究基于盐胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)耐盐品种GIB和盐敏感品种LS根和叶的转录组数据,通过生物信息学方法筛选出17个差异表达的MsNAC转录因子家族成员,并对其序列特征、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的表达模式等进行分析。结果显示,17个MsNACs均具有NAC典型的NAM结构域,且蛋白结构相似。系统进化分析将17个MsNACs分成8个亚族,各亚组成员具有高度相似的保守基序。顺式作用元件分析发现,有15个MsNACs具有ABA响应顺式元件ABRE。转录组数据表达模式分析与RT-qPCR验证结果显示MsNAC1,MsNAC2,MsNAC35,MsJUB1和MsNAC40基因在盐处理下GIB叶中上调表达,在LS叶中下调或者未发生变化,推测这些基因参与调控紫花苜蓿的耐盐反应。本研究为进一步研究紫花苜蓿NAC转录因子响应盐胁迫功能提供参考依据。     

黄花苜蓿MfNAC34基因克隆及特性分析

NAC转录因子具有调节植物生长发育和应答非生物胁迫的功能。本研究从内蒙古锡林郭勒草原野生黄花苜蓿材料中克隆获得1个NAC家族蛋白基因MfNAC34(GenBank登录号为MH481768),分析MfNAC34基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和转录激活特性。结果显示：MfNAC34基因开放阅读框序列为621 bp,编码亲水性蛋白质,分子量为23.52 kD,理论等电点为4.09。MfNAC34为定位在细胞核内的胁迫诱导的转录因子,且转录激活域位于其C端。     

长叶红砂RtMYB1基因的克隆及表达

MYB转录因子家族在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要的调控作用。基于转录组测序数据,从珍稀泌盐盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)中克隆一个MYB转录因子基因,命名为RtMYB1。RtMYB1基因具有780bp的ORF(open reading frame)序列,编码236个氨基酸残基组成的蛋白。RtMYB1能够被盐、冷、高温、紫外照射(UV)和干旱(PEG)5种非生物胁迫诱导表达,这表明RtMYB1基因可能参与长叶红砂响应非生物胁迫的调节途径。本研究为深入了解长叶红砂的抗逆机理及发掘优异的抗逆基因奠定了基础。     

紫花苜蓿耐苏打盐碱相关基因的转录组学分析

为了揭示紫花苜蓿适应苏打盐碱环境胁迫机制,本试验采用Illumina HiSeq 4000测序技术对紫花苜蓿叶片进行转录组测序并对基因进行功能预测,测序共获得91 853个Unigenes,总碱基数为65 369 474 bp。Unigenes序列长度分布显示,测序质量较好,可信度高,其中,45 540个Unigenes与其它生物的基因有不同程度的同源性,通过GO,COG及KEGG数据库注释,将Unigenes具体定位到次生代谢物的生物合成途径、抗生素合成途径、光合作用途径等。紫花苜蓿叶片苏打盐碱胁迫响应中GH3,MYB,HSF等转录因子均发生不同程度的上调,而EREBP转录因子总体受到抑制,同时候选了4CL,PP2C基因及相关转录因子。从91 853个Unigenes中共检测到10 949个SSR位点,包括6类核苷酸基序,A/T出现频率最高,其次为AG/CT和AAG/CTT。qRT-PCR荧光定量检测5个基因的表达趋势与RNA-Seq分析结果一致,证明RNA-Seq测序的可靠性。本研究通过对紫花苜蓿转录组研究,为优质牧草的分子生物学研究提供数据库来源。     

转录组学解析紫花苜蓿雄性不育系花粉败育机制

为探索紫花苜蓿(Medicago sativa L.)雄性不育的分子机制，选取紫花苜蓿细胞质雄性不育系(MSJN1A)与保持系(MSJN1B)花蕾发育早期的花药进行细胞学观察，并采用高通量Illumine Hiseq2000测序平台，进行转录组测序，对测序结果注释、筛选与分析。结果表明：花粉败育始于四分体后期，于单核早期出现明显的不育现象；两系花药间共存在4 284个差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)(FDR<0.001,|log₂FC|>2);GO功能注释分析表明，DEGs涉及物质代谢、细胞过程、转运蛋白活性等功能；KEGG通路富集分析表明，DEGs涉及淀粉与蔗糖代谢、戊糖与葡萄糖醛酸相互转化、糖酵解/糖异生、苯丙烷生物合成等途径；转录因子分析表明，DEGs涉及bHLH,MYB,PHD等已知与花粉发育相关的转录因子家族。本研究通过对紫花苜蓿花药结构观察和转录组分析，为研究紫花苜蓿雄性不育成因机制提供参考。     

TRIM9基因调控牛支原体脂质相关膜蛋白诱导EBL细胞IL-1β表达的研究

为探究宿主TRIM9基因通过调控牛支原体(Mycoplasma bovis,M. bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞释放致炎细胞因子IL-1β的相关机制,本研究通过M. bovis LAMPs刺激EBL细胞后,利用荧光定量PCR(qPCR)方法检测细胞中TRIM9和IL-1β基因的转录水平,结果显示TRIM9基因转录水平上调2.9倍,IL-1β基因转录水平上调2.5倍。构建pEGFP-C1-TRIM9荧光报告质粒并转染EBL细胞,利用共聚焦显微镜观察TRIM9在EBL细胞中的定位,结果显示TRIM9蛋白能够瞬时表达于EBL细胞浆。通过将构建的pCMV-C-HA-TRIM9重组质粒和si-TRIM9干扰质粒共转染EBL细胞,经2μg/mL M. bovis LAMPs刺激12 h后,采用qPCR和ELISA检测IL-1β的转录水平和表达情况,结果显示,与M. bovis LAMPs刺激正常EBL细胞组相比,过表达TRIM9组中IL-1β在转录水平和蛋白表达水平均无明显变化,而敲低TRIM9组中IL-1β转录水平和蛋白表达水平均显著上调(分别上调33倍和30倍)。同时利用western blot检测p65蛋白磷酸化水平,分析NF-κB信号通路激活情况,结果显示,与M. bovis LAMPs刺激正常EBL细胞组相比,TRIM9蛋白过表达组NF-κB信号通路激活水平无明显变化,而敲低TRIM9组p65磷酸化水平提高,促进NF-κB信号通路激活。综上结果表明敲低TRIM9基因能够促进M. bovis LAMPs通过NF-κB信号通路诱导EBL细胞释放IL-1β。本研究为进一步明确宿主蛋白参与抗牛支原体天然免疫应答的机制奠定基础。     

紫花苜蓿bZIP基因家族的鉴定、 进化及表达分析

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。目前在许多植物中已发现大量的bZIP转录因子,这些bZIP转录因子成员广泛参与种子贮藏基因的表达、植物的生长发育、光信号传导、病害防御、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等各种信号的反应。本研究首次从紫花苜蓿(Medicago sativa)全转录组水平鉴定出bZIP转录因子家族共包含138个基因,根据bZIP蛋白序列进行系统进化分析可以将其分为10类;对MsbZIP基因的系统进化分析表明该基因家族在分类上有很高的保守性。该转录因子家族的基因密码子偏好性分析表明,MsbZIP基因密码子偏好使用A/T碱基。此外,MsbZIP基因GO功能注释分析结果显示,138个MsbZIP基因最终分为23个GO分类,总体包括分子功能和生物学过程两类。相关性分析结果表明,共有372对基因表达相关性极显著(P0.01)。本研究可为紫花苜蓿bZIP转录因子功能特性、进化历程和生物功能的深入研究奠定基础。     

紫花苜蓿ＷＲＫ转录因子基因的克隆与亚细胞定位

 ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。