血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒（FAdV-4） Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体，为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化，截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段， PCR扩增其基因序列，连接至pET-32a（+）构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化，并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合，利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性细胞株，再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统，获得大小约为67 kD的 Fiber-2截短蛋白，以包涵体的形式出现，经纯化后可获得单一的特异性条带，经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（2C2、 4F6、 5A5、 6G10和10B5），其抗体分泌稳定性、特异性好，诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400，腹水抗体效价为1:320000~1:1280000，秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、 4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa链； 5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型，轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系 （LMH）进行IFA检测，结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。     

一株禽腺病毒4型Fiber2蛋白单克隆抗体的制备

制备禽腺病毒4型（FAdV-4）Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交（Dot blot）和间接免疫荧光试验（IFA）进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定

用E.coli原核表达并纯化的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)非结构蛋白3B免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA筛选出分泌鼠IgG的杂交瘤细胞株,将该杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水,用间接ELISA法筛选获得6株能稳定分泌抗3B蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、4B1、4D7、4E11、7B2、8B11.鉴定结果显示,4B1和4E11细胞分泌IgG1,其余4株细胞分泌IgG2b;纯化后6株腹水单抗的纯度达90%以上,对3B蛋白的ELISA滴度均可达到1:100 000以上;6株单抗均不与FMDV结构蛋白VP1和3D非结构蛋白发生反应;间接免疫荧光试验证明所制备的单抗能够识别3B蛋白;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存6个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定.     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备鸭瘟病毒(DPV)gB蛋白单克隆抗体,为建立DPV快速诊断方法及进一步鉴定DPV的抗原表位奠定基础。【方法】克隆DPVgB基因,构建其表达载体并进行原核表达,纯化DPV gB蛋白,以其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,进行间接ELISA及亚克隆筛选,并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】PCR扩增出915bp的目的基因,成功连接于pET-28a载体,并转化大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,获得4株稳定分泌抗DPV gB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6,间接ELISA检测其腹水效价分别为1∶103、1∶103、1∶105、1∶103,亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV gB蛋白特异性结合,IFA结果表明4株单抗是针对DPV产生的。【结论】成功获得了特异性针对DPV gB蛋白的单克隆抗体。     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

抗Luman募集因子N端单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗Luman募集因子N端(Luman-recruiting factor N terminal,LRF-N)蛋白的单克隆抗体。【方法】PCR扩增LRF-N端的194bp序列,构建LRF-N重组质粒pGEX-LRF-N,转染BL21(DE3)菌,诱导表达并纯化GST-LRF-N融合蛋白,以其作为抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,免疫4次,每次间隔10d,第4次加强免疫3d后采取小鼠脾脏,分离脾细胞,与SP2/0细胞融合,用ELISA和Western blot进行阳性细胞株的筛选和鉴定,对获得的杂交瘤细胞的细胞核型、分泌稳定性以及所分泌的单克隆抗体进行鉴定。【结果】pGEX-LRF-N在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,GST-LRF-N蛋白分子质量约为33ku,与预期结果一致。试验共获得3株稳定分泌抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2AC9、2AG10和3G7。单抗2AC9、2AG10、3G7能够特异性地识别GST-LRF-N蛋白,亚型鉴定结果显示,其重链分别为IgG2a、IgM和IgG1。【结论】获得的抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株2AC9、2AG10、3G7单抗特异性良好,能够稳定分泌抗体,可用于小鼠LRF蛋白生物学功能及活性的进一步研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析

【目的】制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体,探讨单克隆抗体临床应用的价值及病毒蛋白的结构和功能。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心纯化的PRRSV抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞常规融合,经间接ELISA的筛选和有限稀释亚克隆,获得能稳定分泌鼠抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验等方法分析其特性。【结果】成功地获得了3株稳定分泌抗PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为A61、B47和C65。这3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG1,均具有ELISA、IFA和Western blot特性,细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别为1×27~1×28和1×105~1×106。特异性测定结果表明,3株单克隆抗体与Marc-145细胞、猪2型圆环病毒和猪细小病毒均无交叉反应。Western blot测定结果表明,3株单克隆抗体均能特异性识别PRRSV-GP5蛋白。【结论】获得了特异性识别PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体,为PRRS免疫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

抗大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体制备

【目的】制备大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体,为大片吸虫病的免疫诊断、防治等研究奠定基础。【方法】利用杂交瘤技术,以大片吸虫分泌排泄抗原为免疫原制备单克隆抗体,并用ELISA、硫氰酸盐洗脱法等方法鉴定其生物学特性。【结果】通过间接ELISA筛选及3次亚克隆后,共获得5株大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6D3、6B4、7D2、7D1和7D4。经鉴定,发现5株杂交瘤细胞染色体数为90～110条,均大于亲本细胞,其亚类鉴定分别属于IgG2b、IgM、IgM、IgG1和IgM,其轻链均为κ型;5株单克隆抗体（6D3、6B4、7D2、7D1、7D4）的上清效价分别为1∶400、1∶3200、1∶25600、1∶6400和1∶6400,腹水效价分别为1∶104、1∶104、1∶105、1∶107和1∶106;而表位测定结果表明,5株单克隆抗体中,6D3与7D1、7D2以及7D4与7D1、7D2作用于不同表位,6D3与6B4 可能识别同一表位或重叠表位,或同一表位有空间位阻,7D4与6D3以及6B4与7D4、7D1、7D2可能具有空间位阻;5株单克隆抗体的相对亲和力为：6B4＞7D4＞7D1＞6D3＞7D2;5株杂交瘤细胞株均能稳定地分泌单克隆抗体。【结论】制备获得的分泌排泄抗原单克隆抗体可用于大片吸虫病的诊断和免疫机理等方面的进一步研究。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。     

产单核细胞李斯特菌溶血素O单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗产单核细胞李斯特菌溶血素O(LLO)的特异性单克隆抗体。【方法】用LLO重折叠的原核表达产物LLO-his免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞,与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,经间接ELISA法筛选、多克隆及单克隆分离出阳性细胞株后,再用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,间接ELISA法测定其效价及相对亲和常数;用HBT单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚型;常规方法制备染色体,观察细胞株染色体数目及标志染色体;Western blot检测抗体的特异性。【结果】获得了2株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为3F5-G3和2B4-C8,其腹水效价分别为1∶(1×105)和1∶(1×107);染色体分别为97±5和93±8条,且观察到标志染色体;相对亲和常数分别为0.49和0.26μg/mL;抗体亚类均为IgG1,轻链均为κ链。特异性鉴定结果表明,2种单克隆抗体均可与LLO蛋白发生特异性反应,而与载体蛋白不发生反应。【结论】获得了抗LLO的特异性单克隆抗体。     

抗鸭副粘病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

【目的】制备抗鸭副粘病毒(DPMV)的单克隆抗体,为鸭副粘病毒病免疫学诊断方法的建立奠定基础。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯DPMV,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2/0融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制(HI)试验等方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并测定其生物学特性。【结果】筛选到7株能稳定分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为J28、F4、B3、E39、E41、A12和A30。这7株单克隆抗体都具有ELISA和1FA特性,其中J28和F4还具有HI和中和特性。免疫球蛋白亚类测定结果显示,J28和F4均为IgG1,其他5株均为IgM。相加ELISA试验结果显示,单抗B3,J28与F4,A30与E39/E41/A12分别识别3个不同的抗原位点。特异性测定结果显示,7株单克隆抗体与雏番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)及正常细胞均无交叉反应。【结论】筛选出了7株具有ELISA、1FA等特性且分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并明确了各株单克隆抗体的特性,为鸭副粘病毒病的免疫治疗和临床诊断奠定了基础。     

抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2单克隆抗体的制备

【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功构建了GST-Atac2融合蛋白表达载体,于37℃下220r/min振摇5h,当IPTG终浓度为0.1mmol/L时,GST-Atac2在E.coli BL21(DE3)中高效表达,GST-Atac2融合蛋白大小约为30ku,与预期结果一致。获得1株稳定分泌抗Atac2抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C7。单抗1C7能够特异地识别GST-Atac2蛋白,效价为1∶2×105;亚型鉴定表明其重链为IgG1,所得单克隆抗体的亲和常数为2×105。【结论】获得了1株特异性好、能够稳定分泌抗果蝇Atac2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

抗MATSA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗鸡马立克氏病肿瘤相关表面抗原(Marek’s disease tumor-associated surface antigen,MATSA)的单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb),为马立克氏病的相关研究及研制以MATSA单克隆抗体为载体的抗肿瘤药物提供材料。【方法】用纯化的MATSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其染色体进行分析。将阳性杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠,制备McAb腹水,采用硫酸铵盐析法粗提McAb,并鉴定其所属亚类。【结果】获得了3株能稳定分泌MATSA McAb的杂交瘤细胞株B3、H6和D6,其培养上清液抗体效价为26~27,Balb/c小鼠接种细胞制得的腹水效价为210~211。染色体分析结果显示,3株杂交瘤细胞染色体数目均为52±2对。3株杂交瘤细胞株所分泌的McAb均为IgG 2b亚类,可与MSB1细胞反应。【结论】获得了MATSA的McAb。     

抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性

利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,取小鼠脾脏细胞与杂交瘤细胞融合,筛选出2株能稳定分泌抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3和2F4。体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,经纯化后,得到2株均为IgG1型的单克隆抗体mAb1E3和mAb2F4。间接ELISA方法测得mAb1E3的效价达到1∶4 10×105,对Gly m Bd 28K蛋白的半数抑制率（IC50）为23.99 μg·L-1,与花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反应率均低于0.1%。该单克隆抗体的制备为Gly m Bd 28K致敏蛋白的检测以及抗原表位的鉴定奠定了基础。     

Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性.