团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

大黄鱼Myostatin-1基因启动子克隆及生物信息学分析

Myostatin基因属于TGF-β超家族,是动物骨骼肌生长发育的负调控因子。在已克隆大黄鱼Myostatin-1基因编码序列的基础上,采用基因组步移的方法,首次克隆到约1kbp的大黄鱼Myostatin-1启动子序列。该启动子序列与已报道的金鲷和大口黑鲈相应序列的相似度分别为90%和75%。该序列具有1个TATAbox、1个CAATbox、5个E-box位点,此外还具有MyoD,USF,MEF2,SP1,NF-Y等多种转录因子结合位点。     

大黄鱼高温适应的转录组学分析

为了探究大黄鱼高温胁迫条件下基因表达水平的变化,实验利用Illumina Hiseq 2500的125 pair-ended测序模式分别对大黄鱼高温处理组和常温对照组进行了转录组测序。对照组(3个生物学重复)和高温处理组(3个生物学重复)分别获得15.28和13.92 Gb测序数据,GC含量平均值约为51%。过滤后的高质量测序reads使用Bowtie2软件比对到大黄鱼参考转录组序列上估计基因表达量,进而进行基因表达差异统计学检验。以常温对照组为参比,高温处理组中阈值设为|log2(FC)|2和FDR0.05,共检测到1 259条显著差异表达基因。其中,821条基因为高表达,438条基因为低表达。随机选取12条差异表达基因,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行了验证,结果证实转录组分析可靠。进一步将所有差异表达的基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,结果发现大量差异表达基因的功能与氧化还原反应、蛋白质折叠和去折叠、糖和脂代谢以及某些疾病的发生相关。该研究结果为下一步深入研究大黄鱼高温适应的调控机制提供了重要的参考材料。     

大黄鱼UBXN1基因鉴定及其过表达后的转录组分析

为探究UBXN1在大黄鱼抗盾纤毛虫感染中的作用及其可能涉及的免疫信号通路,本实验采用RT-PCR鉴定了大黄鱼UBXN1基因,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析; 采用实时荧光定量 PCR(qPCR)探究UBXN1在多个组织的表达情况,及盾纤毛虫感染下的表达变化;免疫荧光分析UBXN1的亚细胞定位;转录组筛选UBXN1过表达后的差异表达基因。结果显示：UBXN1基因cDNA全长为915 bp,编码304 个氨基酸。蛋白序列同源比对和结构预测表明UBXN1是一个进化保守的蛋白,包含UBA和UBX结构域。qPCR分析表明UBXN1呈组成型分布表达,脑中表达量最高,其次是肝脏、心脏和肾脏,在肌肉中表达量最低;盾纤毛虫感染大黄鱼,UBXN1在脾脏、脑、肝脏和肾脏表达量早期显著升高,后期逐步恢复至正常水平。亚细胞定位分析表明,UBXN1在大黄鱼肾脏细胞质和细胞核均有表达。在293T细胞过表达UBXN1,转录组分析筛选到12个上调基因,4个下调基因,其中RPL41/RPL39/XIST/RNA45SN4表达量显著增加,而ATP8/ND4L表达量显著减少。这些研究结果表明UBXN1在大黄鱼抗寄生虫免疫应答中发挥重要作用, 并为进一步深入研究UBXN1的免疫调控信号通路奠定基础, 这是目前在鱼类首次报道UBXN1。     

大黄鱼生长速率差异个体肌肉组织的转录组比较分析

为了探究大黄鱼生长性状的分子调控机制,实验从同一个网箱内养殖的大黄鱼中选取生长速率较快的体重均值为(527.1±83.6) g的个体182尾、生长速率较慢的体重均值为(238.4±52.3) g的个体230尾,共412尾进行研究。对其肌肉组织进行总RNA提取和转录组测序,并对2组进行基因差异表达分析。以Padj <0.05、abs[log₂(FoldChange)]> 1为标准,共筛选到227个差异表达基因,包括125个上调基因、102个下调基因。差异表达基因在NCBI-nr和Uniprot (Swiss-Prot)数据库的注释率分别为99.12%、81.94%。通过差异表达基因的功能注释结果,初步筛选出了可能与肌肉生长相关的候选功能基因,如gdf9、ckm、tnni2和des等。GO和KEGG分析预测出部分与肌肉生长相关的信息,如GO term有肌动蛋白丝组织、肌动蛋白细胞骨架组织、肌动蛋白丝基过程、微管组织中心和发育生长等,KEGG通路有细胞和生长因子、脂肪酸生物合成、转化生长因子-β信号通路(TGF-β信号通路)、胰岛素信号通路和肌动蛋白细胞骨架...     

虹鳟免疫诱导型基因Cathelicidin2启动子功能分析

本研究通过实时荧光定量PCR实验对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Cathelicidin2(Cath2)基因的转录模式进行了分析。结果显示,该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录,在细菌和病毒感染后,转录水平均显著升高。对基因上游调控序列进行启动子和转录因子结合位点预测,发现该启动子具有真核生物典型的TATA盒和CAAT盒结构,基因上游直至第一内含子区域内,密集存在多个免疫相关转录因子结合位点,其中,2个核因子κB(Nuclear factor kappa B,NFκB)预测结合位点均位于核心启动子正链区域。在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾组织细胞系内,绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,表明其具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)模拟的细菌感染和聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid,Poly I:C)模拟的病毒感染。双荧光素酶报告基因检测显示,启动子活性在与NFκB转录因子表达时,增强至4.39倍,证明Cath2基因受NFκB通路调控。研究表明,虹鳟Cath2基因能够在多种免疫刺激诱导下表达,其启动子可以应用为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时,避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

大黄鱼碱性磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系经LPS处理后6 h LcALP表达量降低,12 h显著下调,而poly I:C处理后表达水平持续上升,24 h显著上调至峰值。研究表明,LcALP在大黄鱼胚胎发育调控以及机体免疫防御中发挥重要作用。     

皱纹盘鲍肌动蛋白基因启动子的克隆和序列分析

从皱纹盘鲍雌性个体的足部肌肉提取总DNA后，通过聚合酶连式反应（PCR）技术扩增得到一个扩增产物。经克隆、筛选、确定重组子产物。测序得到了长度为511bp的启动子片段。分析测序结果发现，皱纹盘鲍肌动蛋白基因启动子DNA序列与目前己知的红鲍相应序列的相似度为95%；GC碱基含量为38.93%，较红鲍的低（59.2%）；所得序列含有高度保守的基本表达调控元件，即一个CAAT框和四个TATA框。     

一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的耐药性及耐药基因分析

对一株分离自大黄鱼的致病性溶藻弧菌进行耐药性分析,分别用纸片扩散法、倍比稀释法检测了该菌对磺胺甲噁唑、氟苯尼考、盐酸多西环素、红霉素、盐酸环丙沙星、土霉素、恩诺沙星、硫酸新霉素、氨苄西林钠共9种药物的耐药性,同时用PCR法检测了该菌β-内酰胺酶基因bla CTX-M,喹诺酮类耐药基因(qnrVC,qnrVC5),四环素耐药基因(tetS、tetM)等耐药基因的携带情况。结果表明该菌对氨苄西林钠等药物耐药。对氟苯尼考、磺胺甲噁唑高度敏感。同时该菌携带bla CTX-M,qnrVC 2种耐药基因。本研究的结果为溶藻弧菌病的精准用药提供了数据支持。     

大黄鱼cGPDH和mGPDH基因克隆及低温胁迫下的表达差异分析

为探究cGPDH和mGPDH在大黄鱼(Larimichthys crocea)适应低水温过程中所起的调控作用,本研究采用RACE-PCR技术克隆了大黄鱼cGPDH和mGPDH基因全长cDNA序列,cGPDH和mGPDH基因序列全长分别为1577 bp和2319 bp,包含长度为1050 bp和2193 bp的开放阅读框...     

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。     

大黄鱼mtDNA ND5和Cytb基因的克隆与序列分析

2004年4月,将采自浙江省象山港海区网箱养殖的大黄鱼样本,提取总DNA,通过设计特异性引物对大黄鱼线粒体DNA（mtDNA）的辅酶5（ND5）和细胞色素b（Cytb）基因进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后直接测序。得到ND5的序列1839 bp和Cytb基因序列382 bp。应用primer premier5和MEGA3软件包所作的系统发育分析表明：依据大黄鱼ND5序列所作的进化树总体支持传统的分类地位,大黄鱼更接近塘鳢鱼科。而基于Cytb基因所作的分析表明,黑鳃梅童鱼是大黄鱼在石首鱼科中是遗传距离最小的。     

一种免疫诱导型鲤启动子的克隆与功能分析

为发掘适用于基因工程抗病育种的鱼类启动子,通过实时荧光定量PCR实验对鲤Rab GTP酶(Ras-associated binding-GTPases 1a3,Rab1a3)基因的表达模式进行了分析,证实该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录水平较高,且免疫激活后转录显著增强,符合基因工程抗病育种所需的外源免疫基因转录模式。从鲤细菌人工染色体文库中,使用Rab1a3基因特异引物筛选获得包含该基因区域的文库克隆,测序获得该基因完整序列,以及上下游调控序列。通过生物信息学手段,预测到长度为1014 bp的鲤Rab1a3基因启动子序列,该启动子不具有典型的TATA盒或CpG岛特征,存在多个免疫相关转录因子结合位点。在草鱼肾组织细胞系内验证该启动子活性,结果显示,绿色荧光蛋白基因和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,证实该片段具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,双荧光素酶报告基因检测结果显示,该启动子活性在免疫刺激后增强至免疫刺激前的8.67倍。研究表明,鲤Rab1a3基因启动子有望被开发成为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910转录调控因子rovS基因的克隆及表达研究

为了对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株毒力相关转录调控因子rovS进行克隆及表达研究,实验根据GenBank上登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的rovS基因,然后将该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达.结果显示,该基因有849个碱基,编码282个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2603 V与ATCC13813的rovS基因的同源性最高;经IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为34 ku;用亲和层析后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测效价达到1∶512000.研究结果表明,实验成功克隆与表达了rovS基因,为深入探讨RovS调节因子在调节细菌的代谢、生长和毒力等多种生命活动中的作用提供了理论依据.     

[3]斑节对虾亲环素A （cyclophilinA） 基因的克隆及启动子序列分析

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斑节对虾亲环素A （cyclophilinA） 基因的克隆及启动子序列分析

通过同源克隆和RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)亲环素A(cyclophilin A,CYPA)的cDNA序列.根据已克隆的cDNA序列设计引物,利用染色体步移技术(Cenomic DNA walking)从斑节对虾卵巢组织中克隆了CYPA基因的启动子和基因组DNA序列.测序结果表明,斑节对虾亲环素A(PmCYPA)cDNA全长834 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为495 bp,可编码164个氨基酸;5'非编码区为31 bp,3'非编码区为308 bp.从斑节对虾基因组文库中扩增的CYPA基因组DNA全长3 181 bp,其中包括启动子区域1 173 bp,1个内含子426 bp,2个外显子序列:分别为101 bp和399bp.在5'UTR上游区域有明显的启动子序列,包含一个GC盒和2个CAAT盒,同时还包含AP1、CRE等调控元件,符合真核生物典型的启动子特征.分析基因的结构表明所克隆的PmCYPA符合PPlase家族成员特征,属于此基因家族成员.     

低盐驯化对低盐胁迫下大黄鱼转录组的影响

为探讨低盐驯化对低盐胁迫下大黄鱼氧化损伤和转录组的影响,本实验将体重为(52.46±1.47) g的大黄鱼暴露在盐度为25或20的水体中7 d,再暴露在盐度为10的水体中24 h。结果显示,低盐胁迫显著增加了活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)含量。尽管低盐驯化对ROS和LPO不产生影响,但低盐驯化显著降低了低盐胁迫下大黄鱼ROS和LPO含量,表明低盐驯化缓解了低盐胁迫对大黄鱼的氧化损伤。从低盐驯化vs.对照组、低盐胁迫vs.对照组和低盐驯化+低盐胁迫vs.低盐胁迫实验中,分别筛选到356、478和484个差异基因。GO和KEGG分析发现,差异基因显著富集在GnRH信号通路、PPAR信号通路、凋亡、Toll样受体通路和MAPK信号通路等,表明低盐驯化可以通过调节离子和物质运输、脂类代谢、细胞凋亡和非特异性免疫等来提高大黄鱼的低盐胁迫耐受性。研究表明,低盐驯化可以通过调节离子和物质运输、脂类代谢、细胞凋亡和非特异性免疫等来提高大黄鱼的低盐胁迫耐受性。研究结果揭示了低盐驯化改善大黄鱼低盐胁迫耐受性的分子机制,可为今后工厂化和内陆采用淡水或半咸水养殖大黄鱼提供科学依据。     

东北七鳃鳗NF-κB基因启动子的构建及活性

核转录因子NF-κB (nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-κB基因启动子的活性报告基因,进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制,实验根据此前克隆得到的东北七鳃鳗NF-κB基因的编码序列(coding sequence,CDS),以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗同源基因5′上游启动子特征序列为模板设计引物,克隆获得了东北七鳃鳗NF-κB启动子序列,该序列全长3 169 bp,提交至NCBI数据库GenBank获得登录号MN368861。经AliBaba 2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点,并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1 ...     

基于转录组学解析铜驯化缓解高温胁迫对大黄鱼的氧化损伤

为探讨铜驯化对高温胁迫下大黄鱼(Larimichthys crocea)氧化损伤和基因表达水平的影响,将体质量为(48.92±3.62) g的大黄鱼暴露在铜离子浓度为0和10μg·L^-1的水体中14 d,再暴露在温度为32℃的水体中24 h。结果显示,高温胁迫显著增加了大黄鱼肝脏中活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)含量(P<0.05)。铜驯化对常温下ROS和LPO含量不产生影响,而显著降低了高温胁迫下大黄鱼ROS和LPO含量(P<0.05),表明铜驯化缓解了高温胁迫对大黄鱼的氧化损伤。从高温胁迫组vs对照组、铜驯化组vs对照组和(铜驯化+高温胁迫)组vs高温胁迫组中分别筛选到828个、2 311个和1 084个差异基因。GO和KEGG分析发现,差异基因主要富集在与TCA循环、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工、吞噬体和MAPK信号通路等相关功能上。聚类分析表明,高温胁迫下调了TCA循环、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢、吞噬体和MAPK信号等通路中的大部分基因表达,上调了内质网蛋白加工通路中的大部分基因表达,而铜驯化则对高温胁迫下大黄鱼的这些基因表...     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变.存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709.统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05).