黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。     

白斑综合征病毒(WSSV)在几种经济类淡水甲壳动物中的感染与流行调查研究

2007年江苏、浙江等地暴发养殖克氏原螯虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)病,2008年该病在江苏地区进一步蔓延,调查发现,在一些虾蟹混养池塘,中华绒螯蟹也有批量死亡的现象.本研究通过采集发病池塘中的克氏原螯虾、中华绒螯蟹与日本沼虾,将上述3种淡水甲壳动物进行超薄切片透射电子显微镜观察,同时利用建立的WSSV特异性引物PCR方法进行检测.试验结果表明,在上述3种淡水甲壳动物中均发现类似WSSV颗粒,PCR检测进一步证实已感染WSSV.流行病学调查及人工回感试验表明该病毒对克氏原螯虾和中华绒螯蟹具有较强毒性,日本沼虾则无明显发病症状.     

克氏原螯虾WSD的PCR诊断及组织病理损伤研究

【目的】近年来白斑综合症病毒(WSSV)严重威胁着克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的健康养殖,本研究旨在确定一例克氏原螯虾暴发性死亡的病因。【方法】对患病虾进行临床症状观察,取其鳃、心脏、肝胰腺、肠道、肌肉、眼睛等组织分别进行套氏PCR检测和组织病理学观察。【结果】患病虾临床剖解特征表现为肠段中空无食物,肠壁透明,肠管较细;套氏PCR结果显示患病虾体内WSSV呈阳性;PCR产物测序并进行系统发育树分析显示,该基因序列与WSSV的核苷酸序列同源性为100%,进一步证实本次患病克氏原螯虾体内携带WSSV。病理组织切片显示,该病靶器官主要为肝胰腺、心脏、鳃、肠道,患病虾均表现为中度至重度坏死性肝胰腺炎、中度充血性鳃炎、中度坏死性心肌炎、以及轻度肠炎,肌肉组织未发现明显病变。【结论】推断造成本次克氏原螯虾大量死亡的原因为WSSV感染。     

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。     

浙江省4个地区克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的检测分析

随着市场需求的日益增大,克氏原螯虾的养殖规模不断扩大,但克氏原螯虾养殖业却深受白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的威胁。本次研究主要调查浙江省4个地区克氏原螯虾的WSSV携带情况和WSSV阳性感染率与季节温度变化的相关性。本研究检测了4—8月浙江省4个地区螯虾WSSV阳性感染率和阳性螯虾的血淋巴、鳃、肠的病毒拷贝数。综合4个地区每月实验数据,发现在2026 ℃时,4个地区的螯虾WSSV阳性率都可达60%以上,4—6月为WSSV发病的高危时期,到8月随着水温超过26 ℃螯虾WSSV阳性率显著下降。检测发现在鳌虾的血淋巴、鳃、肠中病毒最低的拷贝数为10³,最高的拷贝数为10¹⁰,这说明病毒会长期潜伏感染,等待温度及其他条件合适时再大量复制。本研究将为在克氏原螯虾养殖过程中防治WSSV提供科学依据。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒和虾虹彩病毒检测及分析

2020年检测安徽省滁州、安庆和合肥的20个稻田养殖的200只克氏原螯虾(Procambarus clarkii)鳃组织中白斑综合征病毒和虾虹彩病毒,结果发现白斑综合征病毒阳性检出率为97.5％,病毒含量达106拷贝/mg的检出率与克氏原螯虾死亡率呈正相关.虾虹彩病毒阳性检出率为13％,只在滁州的3个和合肥的2个稻田的养殖虾中检出.     

盐酸土霉素对人工致病克氏原螯虾的治疗效果研究

用口服患病克氏原螯虾(Procamgbarus clarkii)组织、注射拟态弧菌(Vibrio mimicus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemoloyticus)的方法,人工感染健康克氏原螯虾致病后,定时投喂盐酸土霉素药物饵料,观察了药物饵料对人工致病克氏原螯虾的治疗效果.结果表明,投喂含有盐酸土霉素的药物饵料对人工注射V.mimicus和V.parahaemoloyticus致病的克氏原螯虾有比较好的治疗效果,而对口服患病克氏原螯虾组织致病的克氏原螯虾的治疗效果比较差.但是,与口服患病克氏原螯虾组织致病后未用药物饵料治疗的对照组相比,投喂药物饵料对克氏原螯虾疾病发展有一定的控制作用.推测克氏原螫虾暴发性疾病的致病原因主要是由于致病病毒引起,而致病菌在克氏原螯虾体内的存在,可能导致混合感染而死亡率上升.     

白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究

2007年,在从南京采集的患病养殖克氏原螯虾样品超薄切片中发现大量类似对虾白斑综合征病毒(WSSV)颗粒,结合初步的流行病学调查、人工回感实验及PCR检测结果确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为WSSV。利用建立的特异性引物PCR方法,在江苏省内扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等多处养殖克氏原螯虾体内均检测到该病毒,且在鳃、心肌、神经、肝脏、肠道、肌肉等多处组织中被检出;未检测到另外两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。     

克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因功能初步研究

为探究硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶-1（chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1,CSGalNAcT-1）在克氏原螯虾免疫反应中的作用,利用RACE技术成功获得克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因完整cDNA序列,并通过荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达模式以及在CpG寡脱氧核苷酸（ODN）、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒（WSSV）刺激后的表达情况。结果显示,克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因在中肠的相对表达量最高,其次是近胃段肠,在心脏、胃、肌肉和围食道神经中的相对表达量较低。克氏原螯虾肝胰腺、血细胞中CSGalNAcT-1基因表达量在嗜水气单胞菌和WSSV刺激下呈现出下调及上调,而在注射免疫刺激剂CpG ODN后,CSGalNAcT-1基因表达水平在大部分组织中呈现上调。表明克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因可能在抵御外界病原侵染以及增强自身免疫反应的过程中发挥重要作用。     

氰戊菊酯等4种化学药物对克氏原螯虾的急性毒性及组织病理观察

【目的】评价氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的急性毒性,分析其对克氏原螯虾的组织病理影响,为生态风险评估提供基础数据。【方法】采用静态试验法测定4种药物浸泡下克氏原螯虾的急性毒性作用,分别使用4种药物48 h半致死浓度（LC₅₀）和96 h-LC₅₀的10%浓度浸泡克氏原螯虾48和96 h后取样,基于石蜡切片技术比较分析4种药物对克氏原螯虾肝胰腺和肌肉组织结构的影响。【结果】4种药物浸泡下表现的中毒症状比较类似,且不同浓度组的中毒症状表现出明显的剂量和时间效应。急性毒性试验结果表明,4种化学药物对克氏原螯虾的毒性排序为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。氰戊菊酯对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为4.375、4.252和3.865μg/L,辛硫磷对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为161.301、87.784和81.637μg/L,硫醚沙星对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为76.541、72.509和52.529 mg/L,甲霜灵对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为20.610、5.499和4.141 g/L。组织病理观察发现,以相对低浓度的化学药物染毒克氏原螯虾后,仍会对克氏原螯虾的组织产生损伤和破坏。染毒后的肝胰腺发现部分细胞破裂、皱缩、坏死,B细胞及其内部转运泡体积明显增大且增多,R细胞颜色加深等现象;肌肉整体呈现肌纤维断裂溶解、细胞排列不紧密、出现明显空腔等现象。【结论】氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾的急性毒性具有较大差异。克氏原螯虾在4种化学药物的安全浓度下均能够存活,但会对肝胰腺和肌肉组织产生破坏。     

白斑综合征病毒感染对克氏原螯虾肠道菌群的影响

为揭示白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)后对其肠道菌群的影响,运用16SrDNA基因的高通量测序技术分析健康与人工感染WSSV的克氏原螯虾的肠道菌群的组成及多样性。结果显示,感染组与对照组在肠道丰度及多样性无显著差异,但其优势菌群组成发生变化。对照组优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)和软壁菌门(Tenericute),分别占75.42%和19.17%;感染组肠道优势菌门为变形菌门和拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占78.14%和17.38%。利用LEfSe分析差异菌属发现,感染组与对照组相比,Candidatus bacilloplasma丰度显著减少(P0.05),拟杆菌科(Bacteroidaceae)和黄杆菌科(Flavobacteria)的丰度显著上升(P0.05)。此外,部分潜在病原菌如黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)的丰度在感染后显著升高(P0.05)。以上结果说明WSSV感染导致克氏原螯虾肠道菌群发生变化,提示WSSV或可通过干扰肠道稳态致病。     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.     

亚硝基氮胁迫下WSSV对凡纳滨对虾致病性研究

为评价养殖水环境中亚硝基氮(NO_2~--N)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)危害性,开展NO_2~--N胁迫对凡纳滨对虾感染白斑综合征病毒(WSSV)后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响研究。试验设置NO_2~--N胁迫浓度为6.68 mg·L~(-1),分别注射10~(-4)和10~(-5)稀释度的WSSV提取液,结果显示,胁迫下感染10-4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达90.00%,显著高于无胁迫组(60.00%),相同试验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,NO_2~--N胁迫下凡纳滨对虾鳃组织内WSSV增殖加快,感染48 h后10-4攻毒浓度胁迫组病毒量是无胁迫组1.33倍,72 h时病毒量达到无胁迫组2.00倍。此外,免疫相关酶活性结果显示,NO_2~--N浓度突变导致对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性先升后降。由此可见,NO_2~--N胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内增殖,导致高死亡率,这可能是胁迫造成对虾免疫相关酶活性降低和抗病原感染能力下降所致。     

中草药添加剂对克氏原螯虾生长及免疫力的影响

为了探讨中草药添加剂对克氏原螯虾生长、非特异性免疫力及抗白斑病综合征病毒感染的影响,选取600尾健康的克氏原螯虾(Procambarus clarkii),体质量为(7.70±0.07)g,随机分为4组,其中1组为对照组(D1),投喂基础日粮,另外3组为试验组,分别在基础日粮中添加1.0%大黄(D2)、0.5%大黄+0.5%淫羊藿(D3)、0.3%大黄+0.3%淫羊藿+0.2%黄芪+0.2%板蓝根(D4)。连续投喂60 d后,检测克氏原螯虾生长和血清相关免疫酶指标,并统计克氏原螯虾感染白斑病综合征病毒(WSSV)后的成活率,综合评价几种中草药添加剂对克氏原螯虾的作用效果。结果表明,与对照组相比,D4组显著提高了虾体增质量率和特定生长率(P0.05);D3和D4组显著提高了铜蓝蛋白(CP)的含量(P0.05);3个试验组虾血清中白蛋白(ALB)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)水平均显著提高,甘油三酯(TG)水平均显著降低(P0.05);而3个试验组虾血清中总蛋白质(TP)、酸性磷酸酶(ACP)以及过氧化物酶(POD)水平差异不显著(P0.05)。中草药添加剂组能显著提高攻毒后虾的成活率(P0.05),其中D4组效果最好。综上所述,在基础日粮中添加中草药复合添加剂(0.3%大黄+0.3%淫羊藿+0.2%黄芪+0.2%板蓝根)可以促进克氏原螯虾的生长,提高机体的非特异性免疫力以及抵抗白斑病综合征病毒的能力。     

哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对墨吉明对虾仔虾的致病性

研究了不同浓度哈维氏弧菌与白斑综合症病毒单独、合并浸泡感染,以及不同温度和盐度条件下单独、合并浸泡感染对墨吉明对虾仔虾死亡情况和WSSV携带量的影响。结果表明:高浓度哈维氏弧菌浸泡感染仔虾,48 h死亡率可达100%,高浓度WSSV浸泡感染仔虾,96 h死亡率可达97%;盐度突变可以降低弧菌与病毒浸泡感染对仔虾的致病性;高温条件下(32℃)弧菌对仔虾的致病性较强,低温条件下(26℃)病毒对仔虾的致病性较强;盐度26、水温26℃条件下,合并感染组死亡率较WSSV单独感染组低;哈维氏弧菌感染可以抑制WSSV在对虾体内的复制。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区序列分析

白斑综合征已给安徽省克氏原螯虾产业带来了巨大的经济损失。为了解安徽省白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)分子流行病学,2016年4—8月在安徽省6个市采集9个养殖的克氏原螯虾样本进行WSSV套式PCR检测,扩增病毒可变区ORF94、ORF75和ORF125,将获得序列进行比较分析。结果显示,9个样本均在第1轮PCR扩增中获得阳性结果,其ORF94的重复单元(repeat unit,RU)数量为2、4、7、8和12,2RUs为常见基因型,ORF75的组合RUs总数为3、6、9、10和11,9 RUs为常见基因型,排列顺序为45、102、45、102、3×45、102和45,ORF125的RUs为5~9,其中7 RUs和6 RUs为常见基因型。     

模拟空运过程中克氏原螯虾生理生化指标的变化规律

【目的】明确空运过程中影响克氏原螯虾存活率的关键环境因子,为有针对性地进行空运前预处理提供科学依据。【方法】模拟克氏原螯虾空运条件,将克氏原螯虾放入泡沫箱中,加入冰瓶后进行完全密封（密封组）或打孔通气（打孔组）。模拟空运过程实时监测泡沫箱内的含氧量、温度和相对湿度;模拟空运18 h后采集克氏原螯虾的血清、肝胰腺、鳃丝及中肠等组织样品,分别测定血清溶菌酶（LZM）活性、多酚氧化酶（PPO）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量,肝胰腺SOD活性、总抗氧化能力（T-AOC）、MDA含量及蛋白质羰基含量,以及鳃丝Na+K+-ATP活性;并制作克氏原螯虾肝胰腺、鳃丝及中肠组织石蜡切片,统计模拟空运结束后克氏原螯虾的存活率。【结果】在模拟空运过程中,相对湿度变化不明显,温度和含氧量的变化引起克氏原螯虾应激反应,是影响空运的主要环境因子。经模拟空运后,密封组克氏原螯虾血清LZM活性、PPO活性及MDA含量显著升高（P<0.05,下同）,SOD活性显著降低;肝胰腺蛋白质羰基含量、MDA含量和T-AOC水平均显著高于打孔组及模拟空运前,而SOD活性变化不显著;密封组和打孔组克氏原螯虾经模拟空运18 h后,其鳃丝Na+K+-ATP活性均显著高于模拟空运前。克氏原螯虾经模拟空运18 h后其存活率较高,但模拟空运后暂养1周发现密封组和打孔组的克氏原螯虾存活率均从第4 d开始显著下降,至暂养第7 d密封组克氏原螯虾的存活率仅为59.33%;且其鳃丝有大量附着物,微血管腔结构已完全消失,大部分呼吸上皮细胞脱落、坏死,鳃膜结构遭到破坏。【结论】温度和含氧量是影响克氏原螯虾空运存活率的主要环境因子。模拟空运对克氏原螯虾造成严重损伤且不可逆,在模拟空运结束后克氏原螯虾因自身缺乏修复能力而大量死亡。因此,实际生产中可通过在运输前投喂免疫增强剂,或在运输后优化其暂养环境等方式以提高克氏原螯虾空运存活率,进而确得其引种成功。     

克氏原螯虾暴发性疾病病原及其传播途径的初步研究

为了探讨克氏原螯虾（Procambarus clarkii）暴发性疾病的传染途径和致病病原,取呈现暴发性疾病典型症状的克氏原螯虾的组织与内脏,制作成螯虾肉糜后分为3份,分别采用抗生素除菌、不做任何处理和在100℃水浴锅中保持1 h等3种方法将螯虾肉糜处理后,连续投喂体重（5.6&#177;0.3）g的幼年虾、体重（17.5&#177;0.4）g的青年虾和体重（24.6&#177;0.5）g的成年虾7 d后,继续饲养观察28 d,比较了各试验组螯虾的死亡率。结果表明,口服经过抗生素除菌和未经任何处理的患病螯虾组织能导致健康试验螯虾发病而死亡,而且青年虾和成年虾死亡数量较幼年虾多;与加热处理患病螯虾组织相比,未经处理的患病螯虾组织诱导健康克氏原螯虾发病率最高,抗生素处理组其次,这种结果预示着患病螯虾组织中存在能导致克氏原螯虾疾病发生的致病性病毒和细菌,而且健康的克氏原螯虾可以通过摄食带病原的患病虾受感染。采用盐酸多西环素对患病虾的治疗未显示出疗效。     

中国对虾与日本对虾对白斑综合征病毒耐受力的比较

[目的]比较中国对虾与日本对虾对白斑综合征病毒的耐受力,为WSSV的病害防治提供参考。[方法]在盐度30‰和(24±2)℃下,将体长约8~9 cm的中国对虾(Fenneropenaeus chinensi)与日本对虾(Marsupenaeus japonicus)停食48 h后,投喂感染白斑综合征病毒(WSSV)的死亡对虾,观察其摄食及感染情况,比较这2种虾的对WSSV耐受力。[结果]中国对虾的平均死亡率为63.33%,发病高峰期为4~5 d,而日本对虾的平均死亡率为54.44%,发病高峰期为5~7 d,中国对虾的发病率于日本对虾,发病时间也较日本对虾早。[结论]中国对虾对WSSV的耐受能力要强于日本对虾。