贵州黑山羊促黄体素β基因多态性及其与产羔数的关系

通过对贵州黑山羊LHβ基因序列进行分析,研究贵州黑山羊LHβ基因的多态性及其与产仔数问的关系.结果表明,在贵州黑山羊30只母羊的LHβ基因832 bp核苷酸系列中,共发现2个变异位点,分别位于138 bp和240 bp处,均为同义变异,其中240 bp处碱基由C变成T,且变异前后的平均产仔数相同,而在138 bp处的碱基由G变成C,形成AA和AB 2种基因型,AB基因型的羊比AA基因型的平均产仔数多产1.02只,且差异显著(P<0.01).说明,LHβ基因138 bp住点的多态性与贵州黑山羊繁殖性能之间可能存在相关性.     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

绵羊BMPR1A基因组织表达及其多态性与产羔数的关联分析

为探索BMPR1A基因在不同生理时期(卵泡期和黄体期)和不同繁殖力(单羔组和多羔组)小尾寒羊组织表达特征及其多样性与小尾寒羊产羔数的关系,采用qPCR技术检测BMPR1A基因在小尾寒羊14种组织中的表达特征。同时,采用Sequenom MassARRAY~?SNP技术对BMPR1A基因3个SNPs位点在大群中的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联。qPCR结果显示,BMPR1A在14种组织中均有表达,其中在大脑、下丘脑和甲状腺组织高表达;BMPR1A在卵泡期和黄体期多羔组下丘脑和卵巢组织表达量均高于单羔组,但未达到显著水平。分型发现BMPR1A基因g.41128335AT和g.41127600CT位点在单、多羔绵羊品种间的基因频率和基因型频率达到显著水平。卡方适合性检验结果显示,3个SNPs在大多数绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。关联分析结果发现,3个SNPs多态性与小尾寒羊各胎产羔数均无显著相关,但g.41128335AT和g.41127598AG位点突变型产羔数基本上均高于野生型。以上结果初步表明,BMPR1A基因表达与小尾寒羊产羔数增加存在一定程度的正相关,但3个SNPs与小尾寒羊各胎产羔数均无显著关联,说明它们可能均不是影响BMPR1A基因功能的关键位点。     

人源JAZF1基因真核表达载体的构建及其对胚胎癌细胞凋亡的影响

【目的】构建人源转录因子锌指并列基因1(JAZF1)真核表达载体,并探究过表达JAZF1对胚胎癌细胞存活的影响。【方法】以胚胎癌细胞NCCIT的cDNA为模板扩增JAZF1基因片段,并将其与pRK5-myc载体连接,构建重组质粒,转染至NCCIT细胞;通过实时荧光定量PCR和DAPI染色法分别检测过表达JAZF1对NCCIT细胞中炎性因子IL1-β、IL8、TGF-β转录水平的影响及对NCCIT细胞存活的影响。【结果】过表达JAZF1基因后,促炎因子IL1-β(P <0.05)、IL8(P <0.01)转录水平明显下降,而抑炎因子TGF-β的mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),同时NCCIT细胞出现更明显的细胞凋亡(P<0.01)。【结论】JAZF1可能通过抑制促炎因子IL1-β和IL8的表达来抑制炎症发展,进而抑制畸胎瘤进展。     

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 DREB1A基因导入植物奠定基础     

猪Annexin A2基因真核表达载体的构建及表达

根据猪的Annexin A2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增Annexin A2基因cDNA,并将其克隆到pGEM-T载体后进行测序分析,然后将测序结果正确的Annexin A2基因cDNA亚克隆到pEGFP-N1表达载体上,成功构建了表达载体.将表达载体瞬时转染Marc-145细胞,结果表明:表达载体pEGFP-N1 -ANXA2可以在Marc-145细胞中表达.     

拟南芥DREB1A基因的克隆与植物表达载体构建

用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,序列分析发现,所克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列(AB007787)的同源性为99.69%.利用基因重组技术成功构建了植物表达栽体pBI121-DREB1A,为进一步利用DREB1A基因综合改良植物抗旱性奠定了基础.     

新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-C...     

高原鼠兔HIF-1α基因真核表达载体的构建及细胞表达和定位

利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

策勒黑羊BMPR-IB、MTNR1A和PTGS2基因的RFLP分析

[目的]寻找与绵羊多胎性状相关的DNA标记,为提高绵羊繁殖力的标记辅助选择提供科学依据.[方法]试验以策勒黑羊为主要研究对象,利用PCR-RFLP、DNA测序等技术,对BMPR-IB、MTNRlA和PTGS2基因的遗传多态性进行研究.[结果]策勒黑羊BMPR-IB基因具有多态性,存在三种基因型:++、B+和BB;MTNR1A和PTGS2基因不存在多态.[结论]验证了BMPR-IB基因的A746G突变位点是策勒黑羊多胎性的主效基因,而MTNR1A和PTGS2基因与策勒黑羊繁殖性能关系不大.     

中国抗虫棉GFM Cry1A杀虫基因的合成及表达载体构建

根据苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1A(b)和Cry1A(c)的氨基酸序列,采用植物偏爱密码子,人工合成了全长1824bp的融合GFM Cry1A Bt杀虫基因,并构建了带有多个表达调控元件的该基因高效植物表达戢体pGBI1214AB,以及该基因和修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因的双价杀虫基因植物表达载体pGBI1214ABC。经在烟草中验证,这两种表达载体在植物中可高效表达并赋予转基因烟草抗虫性。为我国抗虫棉的研究打下了基础。     

小鼠SOCS3基因真核表达载体的构建及其对3T3-L1细胞凋亡的影响

【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和pEGFP-N1-SOCS3的核苷酸序列正确率为100%;在荧光显微镜下发现,脂质体组和SOCS3组均有GFP的表达;RT-PCR和Westernblotting检测表明,3T3-L1细胞中SOCS3mRNA表达显著提高(P<0.05);Hoechst 33258染色发现,SOCS3组的细胞凋亡显著;Bax和c-myc基因的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),bcl-2和mcl-1基因表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】SOCS3对脂肪细胞凋亡的发生有促进作用。     

去乙酰化酶SIRT1过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK活性的影响

构建猪SIRT1基因全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染猪原代卵巢颗粒细胞,探讨SIRT1基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明,猪SIRT1基因的CDS区全长大小为2 229 bp,与NCBI发布的猪SIRT1基因m RNA序列(EU030283.2)一致;转染p EGFP–C1–SIRT1载体的颗粒细胞中SIRT1的m RNA表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组(P0.01);p EGFP–C1–SIRT1转染组细胞中,AMPK–α1和AMPK–α2基因的m RNA表达量显著高于空载体对照组,且细胞中AMPKαThr172位点的磷酸化水平显著升高(P0.05)。结果表明,体外培养的原代猪卵巢颗粒细胞中的SIRT1基因过表达使AMPK的表达显著增加,影响AMPK的活性,推测SIRT1可能通过AMPK在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。     

共刺激分子配体B7-H1基因真核表达载体和转基因细胞的构建

以PHA刺激的小鼠外周血单核细胞中抽提的总RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增出B7-H1基因。按常规方法克隆进pEF6V5His A载体,重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞,48h后进行间接免疫荧光试验,72h后用Blasticidin进行筛选,挑选出能稳定表达B7-H1的细胞株。结果表明：成功地克隆小鼠B7-H1基因并构建了用于表达B7-H1基因的真核表达载体,经间接免疫荧光试验证明,该基因在CHO细胞中得到表达。经Western-blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-H1基因。     

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

拟南芥CBF1基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化

从拟南芥中克隆CBF1基因,转入到植物表达载体pBI121的XbaI和SacI位点,得到中间重组质粒pBI121-CBF1,用EcoRI和HindⅢ将35S启动子与CBF1基因从pBI121-CBF1切下,转入到植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物表达载体p1301-CBF1.将构建的植物表达载体转入农杆菌E...     

猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达量对卵泡闭锁的影响

SIRT1是一种二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)依赖的具有去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子.本研究分析不同闭锁阶段卵泡颗粒细胞中SIRT1基因表达规律性,探讨SIRT1基因表达量与卵泡发育的关系.采用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白表达定位,qRT-PCR方法分析SIRT1 mRNA表达量.结果表明,SIRT1蛋白在晚期闭锁卵泡中最高,健康卵泡中最低,SIRT1 mRNA表达规律性与SIRT1蛋白表达规律性一致.综合分析,颗粒细胞中SIRT1基因随着卵泡的闭锁表达量逐渐升高,SIRT1表达与猪卵巢卵泡发育存在一定相关性.