酸性土壤上花生高效根瘤菌的分离及应用

【背景】 花生（Arachis hypogaea L.）是世界上重要的油料和经济作物。在我国南方产区,大部分花生种植地土壤为酸性。酸性土壤不仅pH值低、瘦瘠,而且还有低磷、铝毒等诸多障碍因素,严重限制了花生的生物固氮及产量。【目的】 本文旨在分离及应用适应酸性土壤的高效固氮根瘤菌,提高花生固氮效率及产量,改良酸性土壤。【方法】 利用平板划线结合镜检的方法,从田间采集的新鲜花生根瘤中分离纯化单菌落;通过PCR技术检测分离物中是否含有结瘤基因nodA和固氮基因nifH,进行根瘤菌的初步分子鉴定;再通过16S rRNA基因序列比对,对根瘤菌进行进一步分子鉴定。候选根瘤菌通过水培回接,检测其与花生的共生结瘤及固氮能力;再通过田间试验评价筛选出来的候选根瘤菌在酸性土壤上的应用效果。【结果】 本研究首先从不同酸性土壤种植区域的花生根瘤中分离、纯化得到256个分离物;其中10株含有nodA和nifH,初步确定为根瘤菌。经16S rRNA基因全长序列测定,发现8株为慢生型根瘤菌（Bradyrhizobium）,2株为根瘤菌属根瘤菌（Rhizobium）。水培回接试验发现,这10株根瘤菌均能够与花生共生、形成有效根瘤,证实是花生根瘤菌。在此基础上,选取4株固氮效率较高的根瘤菌,在酸性土壤上应用。结果表明,4株根瘤菌均能与花生在酸性土壤上形成根瘤,而未接种的花生根部不能形成根瘤。并且接种根瘤菌后显著改善了花生氮营养,提高了花生的生物量和产量。与不接种的对照相比,接种根瘤菌后,花生生物量、产量和氮含量分别提高了27.1%—38.0%、24.7%—104.2%和73.9%—151.3%。【结论】 本研究分离鉴定的花生根瘤菌能够高效固氮和适应酸性土壤,具有重要的应用前景。     

高效固氮花生根瘤菌株的筛选

以采自河北省保定市涞水县的花生根瘤为原材料,进行花生根瘤的采集、菌株分离纯化和回接试验,通过研究接种不同根瘤菌菌株对天府3号花生生长的影响,成功筛选出可与该种花生高效固氮的优良菌株。研究结果表明:接种Hbu074005菌株效果最佳,花生植株干质量较对照组提高52.29%,其结瘤数、果穗数、植株株高等指标也明显优于对照组及其他处理,分别较对照提高235.56%、112.00%、31.31%;菌株Hbu074012、Hbu074004的表现仅次于Hbu074005,干质量分别较对照提高43.13%、35.88%。由结果可以看出,菌株Hbu074005可显著提高天府3号花生的生产性状,是较为优良的花生高效共生固氮菌株。研究结果为高效固氮根瘤菌在花生农业生产中的应用奠定理论基础,具有一定的现实生产意义。     

贵州救荒野豌豆高效根瘤菌株的筛选

【目的】筛选获得结瘤固氮能力强、促生效果好的土著高效救荒野豌豆根瘤菌菌株,为贵州喀斯特地区土壤改良应用提供优质菌株资源。【方法】采用刚果红YMA平板分离培养法,对贵州省不同生态功能区的救荒野豌豆根瘤进行分离、纯化,结合菌体形态结构和16S r RNA测序方法进行细菌种类鉴定,将筛选获得根瘤菌株与豆科模式植物百脉根进行盆栽回接试验,结合菌株固氮酶活性的测定,筛选土著高效根瘤菌株。【结果】从贵州省境内不同生态功能区的救荒野豌豆根瘤样品中分离获得53株形态、颜色和大小各异的根瘤细菌菌株,革兰氏染色后,共获得30株革兰氏阴性（G-）纯化菌株,经鉴定8株为根瘤内生细菌,22株为根瘤菌分属根瘤菌属（Rhizobium）和假单胞菌属（Pseudomonas）,其中Rhizobium的分布频率最高,达91%,豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）的分布频率最高,达27%,分别是分离获得的优势属和优势种。将来自不同地域和种类的根瘤菌与百脉根进行盆栽回接试验后,共筛选得到优良固氮促生根瘤菌6株,即XDVR141-4、ZJVR339-3、WEVR362-3、WXVR365-1、WLVR370-5和B...     

不同施肥条件下接种根瘤菌对鲜食大豆结瘤和产量的影响

为探索不同根瘤菌和减施氮肥对鲜食大豆结瘤和产量的影响,通过盆栽试验,设置不接种根瘤菌常规施肥(CK1)、不接种根瘤菌减氮施肥(CK2)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110常规施肥(U1)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110减施氮肥(U2)、接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436常规施肥(C1)和接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436减施氮肥(C2)处理,研究不同施肥水平和根瘤菌接种水平下鲜食大豆的根瘤数、根瘤质量、根瘤固氮酶活性和产量的差异.结果表明,在常规施肥水平下,花荚期C1处理的根瘤数大于CK1处理,差异极显著;根瘤质量、根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C1处理根瘤数大于CK1处理,差异极显著,C1处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量也显著大于CK1,根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.减氮施肥水平下,花荚期U2处理的根瘤数显著大于CK2处理;U2处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量显著大于C2处理,与CK2无显著差异;根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C2处理的根瘤数显著大于U2处理,根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.不接种根瘤菌水平下,花荚期和采青期CK1、CK2处理的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性无显著差异.接种USDA110根瘤菌水平下,花荚期U2处理的根瘤固氮酶活性显著高于U1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在U1处理与U2处理间均无显著差异.接种CCBAU45436根瘤菌水平下,花荚期C2处理的根瘤固氮酶活性显著高于C 1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在C 1处理与C2处理间均无显著差异.综合说明,接种根瘤菌影响了鲜食大豆的结瘤情况,但对根瘤的固氮酶活性影响不大.减施氮肥影响了花荚期鲜食大豆根瘤的固氮酶活性,但对结瘤影响不大.不同施肥水平和根瘤菌接种水平下各处理间产量均无显著差异,但U2、C2处理的鲜食大豆单株鲜籽粒产量比CK1处理分别提高了4.61％、4.24％,在减施氮肥后接种根瘤菌提高了鲜食大豆的产量.     

豌豆根瘤菌SCAU P10的接种效果、促生特性及系统发育研究

【目的】为获得共生固氮能力强、抗逆促生效果好、宿主识别范围广的高效豌豆根瘤菌。【方法】以前期初筛的优良豌豆根瘤菌SCAU P10为材料,在四川省成都市金堂县和广元市剑阁县验证SCAU P10的田间接种效果,采用常规方法测定菌株的抗逆促生能力,用水培法研究菌株与四川主要豌豆品种“长寿仁”“中豌6号”“无须豆尖1号”“云豌91号”的共生匹配性,通过16S rRNA基因、持家基因、共生基因序列分析研究菌株的系统发育地位。【结果】金堂县豌豆接种供试菌株SCAU P10的鲜豌豆籽粒（青豌豆）显著增产32.3%,两试验地接种供试菌株的根瘤数、株高、绿肥产量（植株鲜重）、饲草产量（植株干重）、植株氮钾积累量均较不接种对照（CK）显著增加。抗逆促生特性试验表明,菌株耐酸耐碱能力均较强,可在pH 4.0～10.0条件下生长,耐盐能力较差,仅能在NaCl浓度0.01%～0.6%条件下生长,能分泌生长素（IAA）,具有较强的溶磷（卵磷脂、磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝）和溶钾能力。匹配性试验表明,供试菌株SCAU P10与四川4个主要豌豆品种均高效匹配。16S rRNA基因、持家基因和共生基因综合分析表明,菌株SC...     

盐碱土高效固氮蚕豆根瘤菌的筛选

通过对云南玉溪澄江大白豆(宿主植物)的根瘤采集及根瘤菌的分离纯化,获得了36株蚕豆(Vicid faba Linn)根瘤菌。为进一步探讨所得根瘤菌的结瘤固氮能力,采用土壤盆栽的方法 ,将这些根瘤菌回接到蚕豆小青皮上。植物生长70 d以后,观察生长状况,综合株高、地上部分干重、结瘤数等生长指标,筛选出2株高效固氮根瘤菌菌株Hbu610041和Hbu610055,为蚕豆的实际生产准备了根瘤菌接种菌株资源。     

外刊文摘

<正> 野生大豆根瘤菌共生固氮体系的观察研究——浙江省农科院,陈德根,《中国油料》,1982,4:45-47.采取盆栽和自然野生群落观察相结合的方法,对野生大豆根瘤共生固氮体系进行研究,结果表明:野生大豆根瘤多为球状,盆栽条件下结瘤多,野外观察仅10-15个.不同发育时期野生和栽培大豆主侧根的根瘤比例不同,野生大豆生长后期根瘤衰老比栽培大豆迟缓,根瘤固氮高峰出现在分枝期,根瘤菌能回接根瘤,对栽培品种都能侵染结瘤,但接瘤效果不同.栽培大豆接种野生大豆根瘤菌后结瘤多,     

半无叶型豌豆根瘤菌接种效应及其竞争结瘤能力分析

【目的】研究不同根瘤菌株对豌豆生长发育、产量及品质的影响,并分析比较不同根瘤菌株的竞争结瘤能力,筛选出与供试豌豆品种匹配较好的根瘤菌株。【方法】在盆栽条件下,应用湖南省华容县棉田低氮土壤,对加拿大半无叶型豌豆MISER分别接种9株豌豆根瘤菌（CCBAU 33109、CCBAU 43228、CCBAU 43227、CCBAU 43232、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43242及商用菌株F98-1和F98-4）。测定豌豆的生育时期;在豌豆盛花期测定豌豆的主要生育特征、根瘤菌的结瘤固氮性能,并用BOX-PCR指纹图谱技术测定根瘤菌的占瘤率;在成熟期测定豌豆的主要生育特征、产量、产量构成因子,及其干籽粒粗蛋白、粗纤维含量。【结果】与不接种对照（CK）相比,接种CCBAU 33109后,MISER盛荚期和成熟期分别延长4.1和7 d（P＜0.05,下同）;接种ACCC 16058后,主茎节数在成熟期分别比对照、F98-1和F98-4多2.8、3.8和2.9节,株高比F98-4高15.67%,粗蛋白含量比对照和F98-1分别提高9.88%和10.63%;接种CCBAU 41242后,豌豆单株籽粒鲜重比商用菌株F98-1提高40.46%;接种菌株CCBAU 43228的占瘤率最高,为57.50%。【结论】根据接种根瘤菌对豌豆生长发育、产量以及品质等方面的影响,结合各根瘤菌株的竞争结瘤能力,本研究筛选出较适于豌豆MISER的豌豆根瘤菌株CCBAU 33109、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43228。     

接种不同根瘤菌对花榈木幼苗光合生理的影响及促生效应

为筛选促生效果好的花榈木Ormosia henryi根瘤菌菌株,建立良好的共生固氮体系,从贵州、浙江、安徽、福建、江西等不同地区采集花榈木根瘤并进行分离鉴定,将通过16S rDNA序列分析及回接验证的20株纯化菌株接种到1年生盆栽无菌花榈木幼苗上,并测定接种后花榈木幼苗光合速率、蒸腾速率、叶绿素荧光参数、生长指标及结瘤指标。研究结果表明:20个菌株接种后结瘤率均在90%以上,其中7号菌株结瘤率、结瘤数、根瘤质量均最高。接种根瘤菌能显著（P < 0.05）提高花榈木幼苗光合速率、蒸腾速率以及叶绿素荧光参数,促进花榈木幼苗的地上地下部分生长及总生物量积累,且接种不同菌株的促生效果差异显著（P < 0.05）。与对照相比,接种根瘤菌的花榈木幼苗光合速率、蒸腾速率、实际光合量子产量分别提高41.6%~197.4%,3.2%~512.9%和4.8%~95.2%;总根表面积、根平均直径、根尖数分别增加3.4%~866.1%,6.7%~193.3%和0.5%~92.1%;苗高生长量、地径生长量和生物量分别增加6.3%~273.8%,10.7%~185.7%和37.9%~310.3%。隶属函数综合评价结果表明:对花榈木幼苗光合生理和生长有显著促进作用的前5个菌株号为15号、16号、7号、18号、17号,可作为花榈木幼苗接种的优良菌株。     

gusA基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的研究

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法,将gusA标记基因分别导入了2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中。结果表明,gusA基因在2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中可以有效表达;对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明,二者之间没有显著差异;在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下,比较了二者的竞争结瘤能力,结果表明,标记菌株形成的根瘤(蓝瘤)的占瘤率与出发菌株差异不显著;为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性,测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量,结果表明,标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异。这说明利用gusA基因研究慢生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的。     

快生型花生根瘤菌株与土著性根瘤菌竞争结瘤能力的探讨

试验结果表明：灰棕紫泥土中的土著性花生根瘤菌数量为１０４个／克干土,并与土壤有机质、含氮量呈极显著相关,而与花生种植年限没有显著相关性;土著性根瘤菌的浸染结瘤能力强,但固氮效率低;接种菌株与土著菌的竞争力差异在于菌株本身优良特性。快生型８５─７菌株占瘤率,固氮酶活性均高,花生荚果增重达显著,极显著水平,竞争力最强;快生型花生根瘤菌株的竞争结瘤性能与花生品种的亲合性有关;不同花生品种根系中的氨基酸含量不同,对菌株占瘤率有影响。     

攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中苜蓿根瘤菌的多样性与促生效应

【目的】为探究攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中苜蓿共生根瘤菌的多样性和促生效应。【方法】利用苜蓿盆栽试验捕获钒钛磁铁尾矿土壤中的苜蓿共生根瘤菌,通过16S rRNA和持家基因系统发育分析来明确苜蓿根瘤菌的进化地位和多样性,并通过根瘤菌回接盆栽苜蓿试验以筛选出高效固氮根瘤菌。【结果】从钒钛磁铁矿尾矿土壤中捕获分离到9株根瘤菌,将其鉴定为中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium);并筛选出高效固氮根瘤菌S. meliloti MX1、B. japonicum MX7和R. leguminosarum MX8,其苜蓿的氮含量分别增加58.8%、205.9%和270.6%,并能促进苜蓿植株生长,显著提高苜蓿的株高、根长和生物量。【结论】攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中含有丰富多样的苜蓿共生根瘤菌,其可应用于钒钛磁铁矿尾矿土壤的苜蓿-根瘤菌联合生物修复。     

绿豆接种根瘤菌的效果

<正> 1988年,我们用花生优良根瘤菌花8号菌株和在中绿1号绿豆上分离得到的绿4号菌株,进行了绿豆盆栽和大田夏播接种效果试验,旨在特定的品种上选出适应能力强、亲和力高的高效菌株,进一步提高共生固氮效率,增加绿豆产量。一、材料和方法 (一)盆栽试验 1、试验处理对照(清水拌种);花8号菌株接种;绿4号菌株接种。共3个处理。     

大豆根瘤菌的分离与筛选

采用盆栽结瘤实验法对从6省市采集的18份土样中分离的160株大豆根瘤菌进行了结瘤与共生固氮效率的比较测定,从中筛选出固氮效率较高的菌株ZX20和SMH12。通过测定2株菌的竞争结瘤能力,确认其可以进入小区田间试验。     

花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效应的研究Ⅰ.花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效应的盆栽试验

以吉林省扶余县三井子镇沙壤土为供试土壤，通过对花生根瘤菌的采集、菌株的分离、纯化和原寄主品种的回接等盆栽试验，筛选出适合吉林省不同花生品种的优良菌株(2644、2656、2697)及其组合(2644 2656、2644 2697)，并对其进行生理生化特性鉴定。结果表明，2644为快生型根瘤菌，表现出相对较强的固氮酶活性，2656、2697为慢生型根瘤菌，也具有较强的固氮活性。修正了花生根瘤菌无快生型或快生型固氮活性低的传统说法。同时这3种优良菌株中两种或两种以上组合接种效果更佳，是生产上推广应用的优选菌株，这为引进优良菌种和组合接菌提供了理论依据。     

石灰性紫色土上铁对花生-根瘤菌共生固氮的影响

试验研究了石灰性紫色土上花生施铁及不同铁浓度对花生根瘤菌共生固氮作用的影响。结果表明：石灰性紫色土上施１．５ｍｇ／２．５ｋｇ土铁能促进快生型花生根瘤菌株８５－７的侵染结瘤与固氮特性和花生生长发育，而ＨＮ１１基因工程菌株在不施铁时也与“天府３号”花生有良好的共生固氮作用。铁对花生根瘤菌共生固氮的影响存在着菌种间差异；铁与花生叶绿素含量有密切关系，叶绿素含量与植株干重、全氮及固氮酶活性之间有显著的相关性；在石灰性紫色土上施铁或接种高效根瘤菌剂能提高花生产量，并能增强根瘤菌株的竞争性。     

小豆根瘤菌接种结瘤条件分析

设计不同的小豆根瘤菌及菌液浓度、侵染时间和接种方式接种小豆推广品种京农5号和京农6号,研究其对小豆结瘤数的影响。根瘤菌BAU73042菌液浓度0.6 OD接种,单株平均结瘤数最多;BAU11017菌株菌液浓度0.2 OD接种,单株平均结瘤数最多。BAU73042侵染京农6号15 min单株结瘤数最多,BAU11017侵染京农5号45 min单株结瘤数最多。菌液浇灌接种方式优于菌液侵染接种;不同品种接种不同根瘤菌的结瘤反应不同。该研究为小豆固氮研究及利用和根瘤突变体筛选鉴定奠定了基础。     

快生型花生根瘤菌株85—7、85—19的生物学特性的研究

1985年,从四川省花生产区栽培的“天府三号”花生根瘤中分离获得了85—7、85—19两个快生型的花生根瘤菌株能利用试验的11种糖类均产酸;且液化明胶和耐盐性达4.5％;与天府花生品种都能进行有效共生,表现出不同感染性;单株增加固氮量16.4—17.1mg,在盆栽试验中固氮酶活性提高;田间试验接种比不接种增产4.38—26.0％。     

高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性

 【目的】筛选高效固氮芽孢杆菌,研究固氮微生物固氮酶活性、竞争适应能力与接种固氮效能的关系,探讨接种固氮芽孢杆菌对根际细菌多样性的影响。【方法】采用无氮培养基富集、加热筛选固氮芽孢杆菌。乙炔还原法测定固氮酶活性,采用盆栽小白菜选育高效固氮芽孢杆菌、研究菌种竞争适应能力与接种固氮效能。通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种。【结果】筛选到了3株固氮酶活性相对较高、固氮能力较强的菌株GD062、GD082和GD282,初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus spp.和类芽孢杆菌Paenibacillus sp.。进一步的研究结果表明菌株GD082竞争适应能力较强,在盆栽试验自然土壤条件下接种固氮效能与施用化肥试验处理效果相当,可望进一步研发用于生产固氮微生物肥料。试验结果同时显示,供试菌株的固氮酶活性与其接种固氮效能并不直接相关,菌株的竞争适应能力对接种固氮效能影响很大,接种固氮芽孢杆菌使小白菜根际土壤细菌多样性显著增加。【结论】接种固氮微生物为农作物提供氮素养分具有生产实践意义。高效固氮菌种的筛选是一个复杂的过程,菌株的固氮酶活性与其接种固氮效能并不直接相关,竞争适应能力对接种固氮效能影响很大。筛选到的芽孢杆菌GD082固氮酶活性较高、固氮能力较强、竞争适应能力很强,可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产用菌种。     

苜蓿中华根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定

为了阐明豆科植物共生反应与免疫反应的协调机制,揭示参与植物细胞侵染、定殖及固氮过程中根瘤菌基因的功能,以苜蓿中华根瘤菌Sm2011为材料,构建了约8 000株Tn5-sacB转座子插入的突变体库。利用巢式PCR检测技术,从中鉴定和筛选出nodC、nifH、smc01188和smc04024等4个特定目标基因的插入突变体及其插入位点。通过结瘤试验考察突变体共生及固氮表型,结果显示:植株接种smc01188突变体28d后,与对照植株相比,该基因突变导致根瘤固氮酶活下降,与慢生型大豆根瘤菌该基因突变体的表型类似;smc04024基因突变不影响植株生长,根瘤发育基本正常;接种nifH突变体后,植株呈缺氮表型,生长发育受阻,根瘤为白色;接种nodC突变体后植株不结瘤,说明Tn5-SacB的插入导致nifH、nodC基因功能丧失。利用PCR检测、鉴定和分离目标基因突变体是一种行之有效的方法。