杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化

采用正交设计的方法,对杨树ISSR-PCR反应中5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物)在4个水平上进行优化试验。建立了适合杨树的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有1×buffer,0.12mmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,3.5 mmol/L Mg2+,1.5UTaqDNA聚合酶和40ng模板DNA。对杨树ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现引物W95142的最适退火温度为56.1℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行杨树种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

苦瓜ISSR扩增条件优化的研究

本文对ISSR-PCR扩增苦瓜基因组DNA的主要影响因子进行了筛选和分析。试验结果表明,25μl的反应体系中采用20~30ng的模板DNA、1μmol/L ISSR引物1、U Tag DNA聚合酶,以及48℃~52℃的复性温度为苦瓜ISSR-PCR扩增条件的最佳选择。苦瓜ISSR-PCR扩增条件的优化为进行苦瓜种群间遗传分化的研究奠定了基础。     

均匀设计在枇杷ISSR-PCR反应体系优化中的应用

本实验通过U255（5^4）均匀设计实验研究,对枇杷ISSR—PCR分子标记体系中模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg^2＋、引物5个组分的浓度进行优化。获得25μL反应体系中各成分的适宜浓度或用量分别是：模板DNA为10ng、dNTPs为0．5mmol／L、TaqDNA聚合酶为1U、Mg^2＋为2．5mmol／L,引物为0．4μmol／L。与单因素梯度优化体系相比,操作简便,简化了实验步骤,获得的实验结果可靠,从100条ISSR引物中筛选出27条扩增良好的引物,并获得了这些引物的最佳退火温度,经琼脂糖凝胶电泳获得了清晰的图谱。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行枇杷种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个标准化程序。     

几种适于庭院的观赏型南瓜品种

小瓜皮葫芦 葫芦科南瓜属一年生蔓性草本,花雌雄同株,单生,西瓜皮色,3-6月播种,每穴1-3粒种子尖部向下,覆土2cm左右,性不耐寒,喜肥沃,湿润,排水良好的土壤。     

栝楼ISSR－PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Tat／DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系：20μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50ng,引物的浓度为0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶的用量为0．8U,dNTPs的浓度为200μmol／L。随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条。经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析。     

荔枝SRAP—PCR反应体系的优化

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点,在荔枝（Litchi chinensis Sonn）中还没有相关的研究报道。为了建立适合荔枝的SRAP反应体系,对反应体系中的DNA模板、Mg^2＋、dNTP、引物、砌DNA聚合酶诸因子的用量进行了探索,确立了适合荔枝的SRAP反应体系为：在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Mg^2＋浓度2．5mmol／L,dNTP0．3mmol／L,引物5mmol／L,TaqDNA聚合酶1．0U。扩增程序为：94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃1min、35℃1min、72℃1 min的条件下运行;随后的35个循环退火温度提高到50℃;最后72℃延伸10min。利用该反应体系对荔枝10个不同品系进行SRAP反应,用5％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果显示：不同品系间DNA谱带多态性丰富。证实该体系稳定可靠,可以用于荔枝的分子标记研究。     

松毛虫DNA的提取及ISSR反应体系的建立

为摸索适宜松毛虫的ISSR体系，以油松毛虫为实验材料，研究了ISSR技术中PCR反应体系的主要成分对ISSR扩增结果的影响。对ISSR反应体系中Mg2+的浓度、引物浓度、dNTP浓度、Tag DNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度进行了探索， 确立了适合松毛虫的ISSR反应体系为： 在25μL反应体系、Mg2+、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5mmol.L-1、0.8μmolL-1、0.20mmol.L-1； 反应体系中Tag DNA聚合酶宜加入1.25Ｕ， 模板DNA应加入15～30ng；引物的最佳退火温度为45.9～52.4℃。并利用该反应体系对14个地区的5种松毛虫进行ISSR反应，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，谱带多态性丰富，清晰稳定，证实该体系稳定可靠。     

梨SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记是一种对ORFs进行扩增的新的分子标记技术，其具有方法简便、稳定，产率中等，不需预知物种的序列信息等特点，近年来在连锁标记的寻找与基因定位，种质鉴定，生物多样性研究，遗传图谱构建及比较基因组学等研究领域得到了应用。本研究开展了SRAP标记技术在梨树上应用的探讨，以3个不同梨品种为试验材料，对影响SRAP-PCR反应体系的Mg２＋、dNTP、引物浓度、Taq酶等因子设置梯度实验，筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳反应条件。结果表明：在20μL反应体系中，模板DNA30ng，MgCl2 2.0mmol/L，dNTP 200μmol/L，正、反向引物各0.2μmol/L，DNA聚合酶1U。     

药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化

基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。     

利用ISSR揭示不同类型月季遗传多样性

本研究应用正交设计法对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行了优化筛选,确立了适合月季ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,25μL的ISSR反应体系中各组分的最适浓度分别为：1×PCR缓冲液、1U Taq DNA聚合酶、800pmol／L 引物、0.16mmol／L dNTPs、Mg^2＋ 1.5mmol／L。筛选了33个ISSR引物,共得到了11个多态性比较高的ISSR引物,占所筛引物的33.33％。利用筛选出的11条ISSR引物对3种月季类型的23份月季材料进行遗传多样性分析,共扩增出477条DNA带,其中多态性位点有14个,平均每条引物可以检测到4.5个多态性位点。用NTSYS软件对样品进行了UPGMA聚类分析,聚类结果表明丰花月季基本能聚为一类,切花月季与藤本月季交叉聚在一起。这表明月季种质的遗传差异与其应用分类的相关性不紧密。     

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态（start condon tardeted polymorphism,SCoT）分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单﹑成本低廉﹑多态性丰富﹑重复性好﹑引物设计简单且通用性良好等诸多优点。本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液（Mg2＋）及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响。结果表明：龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为：10×BufferⅡ（含Mg2＋）2.0μL、DNA模板30ng、引物浓度为30μmol/L、rTaqD-NA聚合酶用量为0.45U、dNTP浓度为4.0mmol/L。适宜的扩增程序为：94℃预变性4min;95℃变性50s,49.5℃退火40s,72℃复性2min,36个循环;最后72℃延伸10min。利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400-2200bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性。     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16（45）正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2＋2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

葡萄SRAP反应体系优化及引物筛选

本试验利用L16（4^5）正交试验设计探寻葡萄SRAP—PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化。充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系。结果表明Mg^2＋浓度为影响葡萄SRAP—PCR反应的关键因素;优化的20μLSRAP—PCR反应体系中各组分的最适含量为：10×Buffer2．0μL,Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0.3mmol／L,引物0．4μmol／L,砌DNA聚合酶1．0U,模板DNA1．0ng／μL。利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对。本研究建立的适于葡萄SRAP—PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础。     

雁鹅ISSR-PCR反应体系的优化*

本试验以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交试验设计L25（55）对PCR反应中5个因素（引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶）在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,快速准确地建立雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系,为进一步进行雁鹅遗传多样性的研究、遗传图谱构建和基因定位奠定技术基础。在25uL的反应体系中,确定雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系为：ISSR引物的浓度为0.20umol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。在正交试验设计的基础上,通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,可以更加准确地确立ISSR-PCR的最佳反应体系。     

观赏蔬菜新品种

鲍鱼瓜 葫芦科南瓜属一年生蔓性草本。花雌雄同株,单生,果黄色。3—6月播种,每穴1～2粒种子、尖部向下,覆土2cm左右。种子发芽温度18～25℃,发芽天数10～15天,生长适宜温度18～35℃,从播种到观赏约70天。不耐寒,喜肥沃、湿润、排水良好的土壤,可食用。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16（45）对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析：1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系（20ul）为：Taq酶1.5U,Mg2＋2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

狗牙根SRAP-PCR反应体系的优化

本研究以狗牙根幼叶为为试材,采用单因子试验和正交设计试验2种方法,对SRAP-PCR反应体系进行优化试验,结果表明狗牙根25μLSRAP-PCR最佳反应体系为：1.5mmol/LMg2＋、0.25mmol/LdNTP、0.4μmol/L引物、1.5UTaq酶和80ng模板DNA,最佳退火温度为50.6℃。运用该体系对30份狗牙根种质进行验证,电泳结果显示扩增条带清晰、多态性高,证明该体系稳定可靠,这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对狗牙根进行分子生物学研究提供了帮助。     

唐古特大黄SRAP反应体系优化及引物筛选

SRAP-PCR反应体系的优化是SRAP分子标记的基础,为建立高效稳定的唐古特大黄SRAP反应体系,进一步对唐古特大黄进行遗传多样性、种质资源分析,本研究在单因素试验基础上,对唐古特大黄SRAP-PCR反应体系主要影响因素Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶进行正交试验L9(34)。结果表明,唐古特大黄最佳SRAP-PCR反应体系为:Mg~(2+)0.5 mmol·L~(-1),d NTPs 0.4 mmol·L~(-1),引物0.2μmol·L~(-1),Taq聚合酶0.06 U·μL~(-1),总体积25μL。利用最优体系进行引物筛选,从58对SRAP引物中获得了30对条带清晰、多态性好的引物对组合。SRAP-PCR优化反应体系的建立为利用SRAP技术进行唐古特大黄种质资源分析、遗传多样性研究等奠定了基础。     

马槟榔DNA提取及其RAPD反应体系的优化

马槟榔是我国特有的仅分布在热带、亚热带地区的珍稀濒危野生果树,马槟榔种子中所富含的植物甜蛋白马宾灵（Mabinlin）在食品甜味剂领域有着广阔的应用前景。为了对我国马槟榔野生种质资源进行遗传多样性分析,本研究建立并优化了马槟榔基因组DNA的RAPD技术最优反应体系。结果表明,采用SDS-CTAB方法提取的马槟榔基因组DNA满足RAPD试验要求;RAPD最优反应体系（25μL）为：引物的终浓度为1.0μmol/L,dNTPs的终浓度为0.2mmol/L,模板DNA的终浓度为1600ng/L,TaqDNA聚合酶用量为40U/L。本研究通过对马槟榔DNA的提取及RAPD反应体系的优化,旨在为下一步对我国马槟榔野生种质资源进行遗传多样性分析提供基础。     

铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA 模板、Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA 模板、2.5mmol·L-1Mg2+、0.15mmol·L-1 dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol·L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。