柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HN株3-1E基因的原核表达与鉴定

根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至p MD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与已发表的国内外相关虫株的3-1E基因序列比较,核苷酸的同源性均在99.2%~99.8%,氨基酸的同源性均在98.2%~100%。然后将重组质粒和表达载体p GEX-4T-1分别用Xho I和EcoR I酶切后构建重组表达载体p GEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量为44.7 ku,诱导表达5 h的蛋白表达量可达到30%以上。     

堆型艾美耳球虫保定株裂殖子3-1E基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina,E.acervulina)关国株(US)3-1E基因序列,设计特异性引物,以堆型艾美耳球虫保定株裂殖子基因组RNA为模板,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得3-1E基因序列部分片段,将此片段克隆至pGM-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠.序列比较发现,此片段与E.acervulina美国株(US)株、E.acervulina QH株cDNA的核苷酸同源性分别为99.4%和99.6%.     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E真核重组表达质粒的构建及其免疫保护性分析

为构建鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)重组真核表达质粒并检测其免疫保护性,本实验将E.tenella表面抗原基因3-1E(E)与鸡IFN-γ、IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核重组表达质粒pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2,同时构建对照质粒pcDNA-E、pcDNA-IFNγ、pcDNA-IL2.经酶切鉴定得到预期大小目的片段,测序结果与预期序列一致.将构建的重组质粒免疫鸡只,经western blot检测表明该重组质粒在鸡体内可以正常表达;对感染鸡只的免疫保护效果显示,pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2组抗球虫指数(ACI)分别为181.04、187.30,具有高效的抗球虫效果,为将其进一步研制成为具有实用价值的抗球虫疫苗奠定了基础.     

堆型艾美耳球虫pcDNA3-3-1E重组表达质粒的免疫保护性

将堆型艾美耳球虫保定株裂殖子3-1E基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组表达质粒pcDNA-3-1E,用碱裂解法大量提取重组表达质粒,纯化后免疫接种1周龄雏鸡。分别设高（100μg）、中（50μg）、低（25μg）3个剂量组,同时设活卵囊接种组、非免疫感染组和健康对照组。在7日龄时首免,14日龄加强免疫,1周后用2.5×105个E.acervulina保定株球虫孢子化卵囊进行攻毒试验。结果显示50μg的剂量可使试验鸡产生较强的抗球虫效果,攻虫鸡的卵囊产量下降67.67%,肠道病变记分降低66.96%,并使鸡的相对增重率达88.36%,ACI值为176.06。     

柔嫩艾美耳球虫HMGB1基因的克隆与原核表达

高迁移率族蛋白是细胞"警报素"的一员,具有多样的生物学效应。本研究利用生物信息学技术从柔嫩艾美耳球虫转录组中鉴定到Et HMGB1基因序列,根据获得的基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊总RNA为模板,通过RT-PCR技术获得Et HMGB1基因,并构建p ET28a-Et HMGB1重组表达载体,进行原核表达。结果显示,Et HMGB1基因全长为432 bp,编码1段全长为143个氨基酸的多肽,该融合蛋白分子质量约为16 000,与预期分子质量一致。Et HMGB1基因的成功克隆和表达为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

堆型艾美耳球虫重组DNA质粒pcDNA3-3-1E的免疫原性

用E.acervulina重组质粒pcDNA3-3-1E免疫雏鸡,观察其对雏鸡细胞免疫和体液免疫功能的影响。将7日龄雏鸡随机分为4组,即空白对照组、pcDNA3.1空质粒组、重组质粒免疫组和卵囊免疫组,每组30只。pcDNA3-3-1E经肌肉注射途径免疫雏鸡,剂量为50μL/只（含质粒1g/L）。7日龄免疫1次,14日龄加强免疫1次。检测雏鸡血液T淋巴细胞增殖率,测定血清抗体水平。结果显示,与空质粒组和健康对照组相比,重组质粒组淋巴细胞的增殖能力明显增强（P〈0.05）,外周血中IgG的含量均显著升高（P〈0.05）,表明pcDNA3-3-1E裸质粒DNA能有效的提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。     

堆型艾美耳球虫重组质粒pcDNA3-1E在鸡体组织中的分布

为了探索堆型艾美耳球虫重组质粒pcDNA3-1E在雏鸡组织中的分布情况,将重组质粒pcDNA3-1E经肌肉注射免疫雏鸡,分别在免疫后15d、30d和60d剖杀雏鸡并采取各种组织,抽提各组织总基因组DNA进行PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳分析,并观察接种后雏鸡的临床特征。结果:免疫后15d各组织均可检测到3-1E基因,而免疫后30d和60d,仅在pcDNA3-1E质粒注射部位检测到3-1E基因,其他组织均未检测到3-1E基因;50μg的pcDNA3-1E质粒并未对雏鸡产生不良影响。由此表明堆型艾美耳球虫重组质粒pcDNA3-1E在雏鸡体内至少可存在15d,30d后质粒DNA仅分布于接种部位,并至少可持续60d,而且未发现异常临床表现。     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板，扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫（Eimeria acervulina）广东株3-1E基因（长度为529bp），将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中，构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母，甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测，表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

柔嫩艾美耳球虫甘肃株钙调域蛋白激酶基因的克隆与表达

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从柔嫩艾美耳球虫甘肃株(E．tenella GS，Et GS)孢子化卵囊的子孢子中提取总RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原钙调域蛋白激酶(CDPK)基因。将Et GS CDPK基因与原核表达载体pGEX-6P1连接，构建了pGEX-CDPK原核表达质粒，并获得高效表达和纯化的CDPK融合蛋白，表达率达35．4％。序列分析表明：Et GS CDPK与文献报道的Et CDPK比较，共有5个核苷酸发生变异，核苷酸同源性为99．6％；有5个氨基酸发生变异，氨基酸同源性为98％。     

柔嫩艾美球虫杨凌株表面抗原SAG10基因的克隆与原核表达

从柔嫩艾美球虫第二代裂殖子总RNA中扩增＆SAG10基因，与pGEM-TEasy载体连接后转化大肠杆菌（E．coli）DH5a，筛选阳性克隆，扩增不舍N端信号肽的编码序列，分别插入表达载体pET-32a（＋）和pMAL-c2X，转化至E．coliRosetta，以IPTG诱导表达。结果表明，pET-32a（＋）-EtSAGIO在E．coliRosetta中的表达产物约占菌体总蛋白的43％，融合蛋白分子质量约为47ku，以包涵体形式存在；而pMAL-c2x-EtSAG10在E．coli Rosetta中表达的重组蛋白为可溶性，表达产物约占菌体总蛋白的35％，融合蛋白分子质量约为69ku。以表达的可溶性EtSAG10重组蛋白100μg／只肌肉注射免疫雏鸡，攻虫后以盲肠病变计分、盲肠卵囊数（OPG）、相对增重率和抗球虫指数（ACI）评价，免疫组相对盲肠卵囊产量为47．7％，抗球虫指数由86．79提高至152．13。提示，重组表达的EtSAG10可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK双抗原DNA疫苗的免疫保护效果观察

将构建的含鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)CDPK和3-1E双抗原的真核重组质粒proEC,在14日龄和21日龄分别免疫AA肉鸡,28日龄感染5×104个E.tenella孢子化卵囊,观察其免疫保护效果.结果显示,攻虫后1周,与proC组相比,proEC组能显著增强淋巴细胞转化和血清抗体水平(P＜0.05);与proE组和proC组相比,proEC组卵囊产量最低但差异不显著(P＞0.05),其相对增重低于proE组和proC组.结果表明,proEC双抗原DNA疫苗对E.tenella攻虫表现出一定双抗原协同保护效应.     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因表达产物的初步免疫效果研究

用柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella子孢子表面抗原基因原核细胞表达产物免疫雏鸡,观察其对球虫攻击的免疫保护作用.将可溶性重组蛋白和包涵体重组蛋白经肌肉注射分别于7日龄、14日龄两次免疫罗曼小公雏,同时设攻虫对照组和空白对照组,于第2次免疫后1周(28日龄)用1 ×104个E.tenella卵囊进行攻毒,观察其诱导产生的保护力.结果表明,3-1E可溶性蛋白组免疫无论从卵囊计数、盲肠病变计分和相对增重均优于包涵体免疫组.说明3-1E基因在大肠杆菌中的表达产物对鸡柔嫩艾美耳球虫的攻击有一定的免疫保护作用.     

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT—PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因，并进行了原核表达和抗原性分析，同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示，克隆的pEtK2基因全长1464bp，具有一个完整的开放阅读框，编码487个氨基酸，具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5h后表达量最多，分子质量约55ku，占菌体总蛋白的32％。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖，可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。     

柔嫩艾美耳球虫MAGL基因的克隆及表达

酰基甘油酯酶(MAGL)是将酰基甘油分解为甘油和游离脂肪酸的丝氨酸水解酶家族成员之一,在酯代谢中起着关键酶的作用,是研制抗鸡球虫药物的重要靶标。本研究利用生物信息学技术预测拼接了柔嫩艾美耳球虫MAGL基因序列,以第二代裂殖子总RNA为模板,通过RTPCR技术获得Etmagl基因。将Etmagl与pCold-43a载体连接,构建pCold-43a-Etmagl重组载体,并在大肠杆菌BL21中获得可溶性蛋白,经亲和层析获得纯化的重组蛋白。结果显示,扩增的Etmagl序列ORF长1 752 bp,编码584个氨基酸,与预测序列相似度为99%,与弓形虫MAGL相似度好(55%);IPTG诱导后融合蛋白高效表达,大小约为114 ku,经免疫印迹鉴定为目的蛋白。本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了柔嫩艾美耳球虫酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶标的抗球虫药物筛选模型奠定了基础。