鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

新城疫病毒HN基因的克隆与原核表达

根据GenBank公布的标准Lasota株的HN基因序列,设计了一对引物,经RT-PCR从标准Lasota疫苗毒中特异性扩增出约1590bp的HN基因。将扩增得到的基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-NDV/HN,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌BL21(pET-NDV/HN)。将重组菌诱导表达后,通过SDS-PAGE分析可见约64.3kDa的特异条带,说明融合蛋白大小与预期理论值相符;Western blotting结果进一步表明表达的蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。     

鸭甲型肝炎病毒1型3C基因的原核表达与多抗的制备

以血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3C基因为序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法进行扩增,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下重组蛋白并获得成功表达,该重组蛋白分子量约为38 ku,能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,经Western-blot分析证明,制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。3C基因在大肠杆菌中可获得成功表达,制备的多抗血清可用于3C蛋白的检测。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

鸭肠炎病毒US10基因的原核表达及抗血清的制备

以鸭肠炎病毒 (DEV) C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得US10基因。构建了其 原 核表达载体pET-32a-US10,经1.0 mmol／L IPTG诱导,目的蛋白在Rosetta(DE3) pLys宿主菌中获得了表达。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白以包涵体形式表达,与预期大小相符。利用 亲和层析法纯化目的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备其抗血清,琼脂扩散法测得抗体效价为 1∶4,间接ELISA法测定抗体效价为1∶102　400。间接免疫荧光试验证实制备的抗血清可特 异性识别鸭肠炎病毒的US10基因编码产物。     

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

新城疫病毒HN基因片段原核表达重组质粒的构建

根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp.将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中,经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达栽体pET-28a,PCR和酶切鉴定表明,克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中.     

新城疫病毒HN基因主要抗原位点区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒GD/GM/03/Ch的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定169～267位氨基酸、318～405位氨基酸和448～571位氨基酸3个区域作为多肽表位候选区域.用含新城疫病毒HN基因的重组质粒为模板,设计引物通过PCR扩增获得HNa、HNb和HNc 3个抗原结构域基因片段,分别经双酶切定向克隆到原核表达载体pBT上进行表达,并构建了pBT-HNa-b-c串联重组质粒进行表达,经过SDS-PAGE和Western-blot分析,验证了表达产物具有反应原性.     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定

[目的]使番鸭细小病毒(DPV)VP3在原核表达系统中正确表达.[方法]根据番鸭细小病毒VP3基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出VP3基因;将其克隆至原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-VP3.将重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白.[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白,约89 k Da;且当IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导时间为6 h时蛋白表达量最大.[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白,并摸索了蛋白最佳表达条件.     

犬副流感病毒NP基因的克隆与原核表达

以犬副流感病毒RNA为模板,采用RT—PCR方法,连接pMD18-T载体获取NP蛋白编码基因核苷酸序列,并应用定向克隆技术,构建原核表达载体pGEX-6P-1-NP。经测序鉴定证实获取的NP蛋白核苷酸序列与GeneBank中标准序列存在两处碱基变异,导致编码的蛋白质出现一个氨基酸的变异。测序结果表明,克隆出的目的基因序列已定向克隆到pGEX-6P-1载体,成功构建了其原核表达载体,并能在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达。Westen—Blotting分析结果显示,表达的GST—pGEX-6P-1-NP重组融合蛋白为82．1kDa,可被犬副流感阳性血清所识别,表明NP基因所编码的蛋白具有一定的免疫活性。     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。     

鸭白细胞介素-2基因克隆、原核表达及生物学活性检测

根据GenBank发表的鸭白细胞介素-2(IL-2)基因序列设计并合成了特异性引物,以经ConA诱导的广州白鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为360 bp的目的基因片段. 将该基因克隆到pMD18-T simple vector上,经酶切、PCR鉴定及序列测定,结果表明获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆. 构建的表达质粒pET-IL-2经BamHI、XhoⅠ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约33 000处出现新的蛋白条带,Western-blotting分析表明,融合蛋白能够被抗His单克隆抗体识别,体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

小鼠激活素受体相互作用蛋白2的原核表达及抗血清制备

[目的]克隆小鼠激活素受体相互作用蛋白2（ARIP2）cDNA序列,利用大肠杆菌表达ARIP2,制备兔抗小鼠ARIP2的多克隆抗血清。[方法]采用RT-PER方法,将小鼠ARIP2基因克隆到pET-32a（＋）质粒,构建ARIP2原核表达载体并转化到大肠杆菌,IgrG诱导融合蛋白的表达,经亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,免疫家兔后制备ARIP2抗血清,分别采用ELISA,Western blot检测抗体效价和特异性。[结果]测序结果表明重组质粒pET32a（＋）-ARIP2构建成功;SDS-PAGE分析表明获得的重组蛋白为可溶蛋白;经过亲和层析后得到有效分离;Elisa法测定的抗血清效价为1：50000;Westernblot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。[结论]成功将ARIP2进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗小鼠ARIP2抗血清,为进一步研究ARIP2功能提供了有力工具。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。     

胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法扩增出MPZJ1206株胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因,将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接获得重组表达质粒pGEX-VP1,进行条件优化诱导表达,将表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析。结果表明,分子量约为52 kDa的重组目的蛋白得到表达。该研究为开发胰腺炎型鸭1型甲肝病毒诊断方法和研究VP1蛋白功能奠定基础。