鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚接种试验

通过对五个批次的无特定病原体(SPF)鸡胚进行鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）同胚接种,收获72～120 h死胚及120 h活胚尿囊液,分别测定NDV和IBV的病毒含量,结果表明NDV病毒含量达到了108.3～108.7EID50/0.1mL, IBV的病毒含量达到了106.3～106.5EID50/0.1mL。两种病毒含量均达到《中华人民共和国兽用生物制品制造及检验规程》（2000版）中鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗病毒含量要求的标准。表明该方法即可降低成本,又简化了生产工艺。     

同胚增殖鸡新城疫-传染性支气管炎病毒效果的研究

本试验将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41强毒株按不同倍数稀释后,同胚接种10日龄易感鸡胚,接种后72、96 h分别收获病毒液,通过鸡胚半数感染量(EID50)测定病毒含量。结果表明:72、96 h收获的病毒液病毒含量差异不明显,均能达到配苗要求,但72h病毒液收量最多。本试验为生产高质量鸡新城疫-传染性支气管炎二联灭活疫苗、降低成本提供了一定参考。     

新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒M41株低免疫鸡胚同胚培养研究

为研究新城疫病毒(NDV)La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株在低免疫鸡胚中进行同胚接种培养的可行性,通过将不同稀释倍数的La Sota株和M41株接种同一低免疫鸡胚,分别测定收获尿囊液La Sota株和M41株含量,确定最佳的稀释倍数以及适宜的培养温度和培养时间。结果显示:La Sota株和M41株以10 000∶5 000的比例稀释,培养96 h病毒含量和收获量最佳,La Sota株含量可达到109.17EID50/0.1 m L,HA效价为1∶1 024,M41株含量可达到106.50EID50/0.1 m L。接种后孵育温度为36.5℃时,每胚收获量比37℃培养增加了1.0～1.2 m L。按照此工艺生产病毒制备疫苗免疫SPF鸡,NDV和IBV抗体均符合国家标准要求。试验探索并优化了La Sota株和M41株在低免疫鸡胚中同胚接种的培养条件,为大规模抗原生产提供数据支持。     

中和温度对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗中鸡传染性支气管炎病毒含量影响的研究

采用分别测定每羽份疫苗成品和每0．1mL半成品胚液鸡胚半数感染量(EID50)的方法探讨了中和温度对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗中鸡传染性支气管炎病毒含量的影响。结果显示，中和温度对该二联活疫苗中鸡传染性支气管炎病毒的EID50有显著的影响。测定病毒含量时，中和条件以中和温度控制在20℃、中和时间45～60min较为合适。     

鸡肾型传染性支气管炎(HK株)活疫苗生产条件的探讨

采取不同浓度的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)接种不同日龄的鸡胚,在不同时间内收获鸡胚液。根据收获时鸡胚的死亡情况、胚液的收获量及胚液的病毒含量,优选IBV活疫苗生产的最佳条件。结果表明,将IBV调整为102.0~103.0EID50/0.1ml,尿囊内接种于12日龄鸡胚中,每胚0.1ml,37℃孵育33h收获,胚液的产毒量和收获量最高。     

鸡传染性支气管炎病毒M41株鸡胚增殖工艺研究

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41标准毒株在鸡胚上的最佳生产工艺,试验用IBV M41株分别以不同剂量接种同一胚龄不同鸡胚、不同胚龄普通鸡胚,以及IBV M41株接种普通鸡胚后不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备病毒液的产量及病毒效价。结果显示:IBV M41株接种无传染性支气管炎病毒母源抗体的SPF鸡胚最佳病毒接种剂量为104.5EID50,接种含有IBV母源抗体的普通鸡胚最佳病毒接种剂量为105.1EID50,最佳接种胚龄为11日胚龄,最佳收毒时间为48 h。按照此工艺制备疫苗,免疫SPF鸡,IBV抗体效价均符合规程标准。研究结果为用鸡胚高效、大量生产IBV M41株病毒抗原进而生产合格的IB疫苗提供了数据支持。     

鸭源新城疫病毒的分离鉴定

从病死肉鸭肝脏中分离到2株病毒(ZH1、ZH2),均能够凝集鸡、肉鸭、绵羊、山羊、猪、人、兔、牛等的红细胞,且这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制.参照NDV毒力判定标准及其方法对分离毒株ZH1、ZH2进行了鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID50)以及1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定,结果ZH1、ZH2株的MDT为52 h和44 h,EID50为106.4/0.1mL和108.64/0.1mL,ICPI为1.93和1.975.表明这2株分离病毒均为NDV强毒株.     

鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗生产工艺改进初探

调整鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗半成品生产的生产工艺,使鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒在一枚鸡胚内繁殖,收获48-96h死胚以及96h活胚的尿囊液,同时检验两种病毒的病毒含量（EID50）,结果表明两病毒含量均达到了《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000版）的要求。应用该生产工艺可提高种蛋的利用率,降低生产成本。     

新疆1株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为了解乌鲁木齐市鸡传染性支气管炎(IB)的流行特征，本研究利用鸡胚培养、RT-PCR、新城疫病毒(NDV)干扰及鸡胚半数感染量(EID₅₀)测定等多种方法分离到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),将其命名为IBV/CK/CH(XJ)/01/2020。对其S1基因进行序列测定及比对分析发现，该分离株在鸡胚上连传5代出现侏儒胚现象，并且可以抑制NDV在鸡胚中的增殖，经计算其EID₅₀为10^-4.58/0.1 mL,为中等毒力毒株，攻毒组与正常组比较，雏鸡气管内有大量黏液且肺脏肿大，表现为呼吸型毒株特征，且其S蛋白裂解位点序列为HRRKR,与TC07-2、GX-NN0903等毒株形成一个独立的发育进化群，均属于TC07-2/GVI-1型IBV;与国内常用的H120、H52、M41等疫苗株的同源性仅为59%～65%。本研究为新疆地区IB的流行病学提供参考，也为当地IB的防控提供了理论依据。     

鸡新城疫病毒与传染性支气管炎病毒同胚培养的试验研究

将鸡新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）按一定的稀释比例等量混合接种9~10日龄SPF鸡胚,让其在同一鸡胚中增殖（简称同胚培养）。试验结果表明,用5倍稀释的ND-Lasota病毒液与 5000倍稀释的IBH₁₂₀病毒液等体积混合后尿囊腔接种鸡胚,能在同一鸡胚中正常增殖,接种后96 h收毒,用红细胞凝集试验（HA）测得NDV、IBV两种病毒的血凝价分别为11 log2和12 log2,不低于各自病毒单独增殖的HA滴度,病毒的增殖基本趋于平衡。同时也证实了在合适的培养条件下,IBV对NDV的复制不会产生干扰。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoR I从质粒pUR-MDVEgB中切下。两端补平后，插入到质粒pEFgpt12s的Pst I酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s-gB。这个载体的特点是，它含有两个启动子，在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因，另一个反向启动子vvP7.5的下游 是标记基因Ecogpt，它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s-gB通过磷酸钙的方法转染用282e4株FPV感染3-4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选 ，得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测，证实了重组病毒中含有gB基因，并且gB糖蛋白也得到了表达。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。     

肉种禽网状内皮增生症、鸡传染性贫血和禽白血病血清学调查

对不同种鸡场不同周龄肉种鸡进行REV、CAV和ALV（A、B亚群）抗体检测。在572份血清样品中，除了一个8．1周龄和15周龄鸡群CAV抗体阳性率分别为13．3％和75％外，其它鸡群无论是否进行CAV疫苗免疫，抗体阳性率均为100％。在212份血清样品中，REV抗体阳性率在16．7％～62．5％之间；ALV（A、B亚群）抗体阳性率在0％～75％之间。本研究结果表明，所检测种鸡群中存在3种免疫抑制性病毒的感染或混合感染。     

Investigation and Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus,Transmissible Gastroenteritis Virus and Pseudorabies Virus of Swine Diarrhea Cases in Shandong Province

To understand porcine viral diarrhea prevalence in the large-scale pig farms of Shandong province, a total of 3 035 clinical samples were detected by PCR from January, 2014 to December, 2016.Those samples were detected for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and pseudorabies virus (PRV). The results showed that the detection rate of PEDV, PRV and TGEV were 67.49%, 9.33% and 3.29%, respectively.During the past three years, the lowest detection rate of PEDV was 48.15% in the fourth quarter of 2014,and the highest was 88.57% in the fourth quarter of 2015.In 2016,the detection rate represented fluctuate declining compared with 2015.The highest positive rate of TGEV was 18.52% in the fourth quarter of 2014,and in the third quarter of 2015 was 15.38%.The lowest positive rate of TGEV was 6.67% in the first quarter of 2016 and TGEV was not detected in the other quarters. The highest detection rate of RPV was 15.68% in the second quarter of 2016,and the lowest was 2.56% in the second quarter of 2014,except the first quarter of 2014 that the PRV was 0. By detecting three kinds of viruses in 69 clinical samples collected passively, the results showed that the detection rate of PEDV,TGEV and PRV were 86.96%,5.80% and 37.68%,respectively. The total single infection rate was 69.57%,the single infection rates of PEDV,TGEV and PRV were 57.97%,1.45% and 10.14%, respectively;The total mixed infection rate was 30.43%,the mixed infection rates of PEDV/PRV,PEDV/TGEV and TGEV/PRV were 26.09%,2.90% and 1.45%, respectively;Obviously, the total single infection rate was higher than the total mixed infection rate. The results showed that the PEDV, PRV and TGEV were prevailing in Shandong province. There were PEDV/TGEV, TGEV/PRV, PEDV/PRV mixed infection, and the number of PEDV/PRV mixed infection was in the majority. However, there was no PEDV/PRV/TGEV mixed type infection. At present, PEDV was the major pathogen of porcine viral diarrhea and the test results could provide the reference to the diagnosis of porcine viral diarrhea.     

山东省猪腹泻病例中PEDV、TGEV和PRV的感染调查与分析

为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料（共3 035份）进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

将 RVG基因插入到鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2 Sm a 位点获得重组转移载体 p U TA- RVG,利用脂质体转染已感染中国鸡痘病毒疫苗株 2 82 E4株 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞 ,收获病毒后 ,用 Brd U法进行加压筛选重组病毒 ,PCR检测到重组病毒 RVG基因 ,Western blot检测出 RVG,从而证实已成功构建了表达 RVG的重组鸡痘病毒     

鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响

为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。     

蜜蜂KBV和APV病毒RT-PCR检测技术研究

根据蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus．KBV)和急性麻痹病毒(Acute paralysis virus，APV)的RNA聚合酶基因序列，参照Don Stoltz报道的引物KBV1、KBV2，美国农业部提供的引物DC62F、DC682R，对美国农业部惠赠的标准KBV和APV的RNA聚合酶基因片段，以及2001—2002年收集到的中国21个省市的180份疑似KBV和APV病蜂RNA聚合酶基因片段进行RT—PCR。对以KBV1、KBV2和DC62F、DC682R为引物扩增出的RNA聚合酶基因片段进行克隆、转化，并对克隆结果测序，证明其可靠性。建立了用分子生物学方法检测蜜蜂KBV和APV病毒的技术，有一定的应用前景。检测结果表明：到目前为止，我国蜜蜂群中未发现KBV和APV病毒病。