利用单碱基编辑系统定点编辑哈萨克羊MSTN基因的研究

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器（cytidine base editor,CBE）在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经Cruiser^TM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE（AncBE4 max）技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。     

欧拉藏绵羊MSTN基因单碱基编辑体系的建立

肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）基因突变时会导致肌纤维增粗，肌肉细胞增多，表现出双肌性状。为敲除欧拉藏绵羊MSTN基因以获得产肉性状更优的欧拉藏绵羊，利用胞嘧啶碱基编辑系统（CBE）在欧拉藏绵羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子。在MSTN基因3个外显子区域上各设计1条sgRNA，分别连接至pEF1a-BE4max-NG-mU6-gRNA-blast质粒并转染欧拉藏绵羊耳成纤维细胞，通过Sanger测序和T-A克隆检测，成功筛选出1条靶向外显子I的符合预期的sgRNA，编辑效率20%。本研究成功通过单碱基编辑技术在欧拉藏绵羊耳成纤维细胞MSTN基因编码区进行定点编辑，为通过分子育种培育产肉性状更佳的欧拉藏绵羊新品种奠定基础。     

绵羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的双荧光素酶载体构建及其与miR-370-3p的靶向验证

为研究绵羊输卵管功能相关的oar-miR-370-3p与抑制素亚基βB （inhibin subunit beta B,INHBB）、SMAD家族成员4（SMAD family member 4,SMAD4）和成纤维细胞生长因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）基因之间的靶向关系,本研究对多个物种（绵羊、人、小鼠、大鼠、猕猴、豚鼠和兔）中miR-370-3p的序列进行了比对,利用RNAhybrid程序预测绵羊miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR可能存在的结合位点,随后分别构建INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果表明,绵羊miR-370-3p序列与其他6个物种不同,但具有一定的保守性。RNAhybrid程序预测到oar-miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR存在结合位点。PCR扩增结果和测序结果表明,INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型载体构建成功。共转染INHBB、SMAD4和FGF18野生型载体和miR-370-3p mimics的双荧光素酶活性极显著或显著低于相应的对照组（P<0.01;P<0.05）;而3种突变型载体和miR-370-3p mimics共转染的双荧光素酶活性均与相应的对照组无显著差异（P>0.05）。表明INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR区域均能与miR-370-3p结合并抑制双荧光素酶活性,验证了INHBB、SMAD4和FGF18基因均是miR-370-3p的靶基因,为进一步研究oar-miR-370-3p影响绵羊输卵管功能与绵羊繁殖力的分子机制提供依据。     

延边黄牛FGF14基因多态性及其对生长性状的影响

本研究旨在探索延边黄牛成纤维细胞生长因子14（fibroblast growth factor 14,FGF14）第3外显子多态性及其对生长性状的影响。应用DNA直接测序法对延边黄牛FGF14基因第3外显子进行测序分析,利用高分辨率熔解曲线HRM分型技术对FGF14基因进行分型检测,探究FGF14基因不同基因型与16和24月龄延边黄牛生长性状的关联性,并进行遗传统计学分析。结果显示,在FGF14基因的631 947 bp处检测到1处A>G突变,有2个等位基因：A和G,存在3种基因型：AA、AG和GG。χ²检验结果表明,FGF14基因的基因型频率和等位基因频率在16和24月龄延边黄牛群体中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。多态信息含量（PIC）分析表明,FGF14基因在这2个群体中均处于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。与生长性状关联分析结果显示,FGF14基因不同基因型对16月龄延边黄牛背高和尻长均具有显著影响（P<0.05）,对24月龄延边黄牛体高、体重、十字部高均具有显著影响（P<0.05）。综上所述,推测FGF14基因对延边黄牛生长发育有一定影响,为后续延边黄牛肉质性状的现代分子育种选育工作提供参考。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

利用单碱基编辑器定点突变猪肌肉生长抑制素基因的研究

【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。     

哈萨克绵羊DRB1基因外显子1和4多态性与布鲁氏菌病的相关性研究

试验旨在对哈萨克绵羊DRB1基因外显子1和4多态性与布鲁氏菌病的相关性进行研究。使用虎红平板凝集试验（RBPT）对试羊的血清进行血清学检测，参考GenBank中绵羊MHC ClassⅡ区DRB1基因序列（登录号：NC_040271.1），对其外显子1和4片段设计引物，采用PCR-SSCP和DNA测序技术对230只哈萨克绵羊的DRB1基因进行多态性检测，分析其多态位点与哈萨克绵羊布鲁氏菌易感性之间的关系。RBPT检测发现66只哈萨克绵羊为布鲁氏菌感染阳性，阳性检出率为28.7%。外显子1片段存在一个SNP位点（F1-G22A），测序确定两种基因型（GG、GA），优势等位基因和基因型分别为G、GG，F1-G22A多态位点的易感基因型为GA。卡方检验表明，哈萨克绵羊DRB1基因F1-G22A多态位点与布鲁氏菌易感性的相关性不显著（P>0.05）。通过生物信息学在线软件分析得出，F1-G22A多态位点导致了RNA二级结构的改变和最小自由能的降低，引起了蛋白质二级结构的改变。DRB1基因外显子4片段未发现SNPs。由此得出，哈萨克绵羊DRB1基因F1-G22A多态位点与布鲁氏菌易感性可能存在一定的相关性。     

利用CRISPR/Cas9n系统编辑绵羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因

成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达...     

CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞（PEF）中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降，从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs，并以单链寡核苷酸的形式合成，退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接，构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体，用Sanger软件进行测序；将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞，48 h后收集细胞，用流式细胞术分选检测细胞转染效率，用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率；用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后，靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明，针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中；流式细胞术分选结果显示，转染效率约70%；半定量PCR结果表明，与对照组相比，3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达（P<0.01），其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%；Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组；实时荧光定量PCR结果表明，Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组（P<0.05），且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高（70%）。半定量PCR结果显示，转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达，表达量为对照组的25%~30%（P<0.01）。免疫荧光检测结果表明，敲降SUV39H1和SUV39H2基因后，组蛋白H3K9me3水平显著降低（P<0.05）。因此，本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2，并下调其催化的H3K9me3水平。     

猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C＞T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止.利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为A A,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍.PCR扩增CD...     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5 μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组（P < 0.05）;采用7.5 μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率（83.80%）和囊胚率最高（35.39%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）,而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率（83.98%）和囊胚率最高（55.62%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著（P < 0.05）。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5 μg/mL CB 处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5 μg/mL CB 处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

Generation of PDX‐1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9‐system into porcine zygotes via electroporation

Recently, we established the GEEP (“gene editing by electroporation of Cas9 protein”) method, in which the CRISPR/Cas9 system, consisting of a Cas9 protein and single guide RNA (sgRNA), is introduced into pig zygotes by electroporation and thus induces highly efficient targeted gene disruption. In this study, we examined the effects of sgRNA on the blastocyst formation of porcine embryos and evaluated their genome‐editing efficiency. To produce an animal model for diabetes, we targeted PDX‐1 (pancreas duodenum homeobox 1), a gene that is crucial for pancreas development during the fetal period and whose monoallelic disruption impairs insulin secretion. First, Cas9 protein with different sgRNAs that targeted distinct sites in the PDX‐1 exon 1 was introduced into in vitro‐fertilized zygotes by the GEEP method. Of the six sgRNAs tested, three sgRNAs (sgRNA1, 2, and 3) successfully modified PDX‐1 gene. The blastocyst formation rate of zygotes edited with sgRNA3 was significantly (p < 0.05) lower than that of control zygotes without the electroporation treatment. Our study indicates that the GEEP method can be successfully used to generate PDX‐1 mutant blastocysts, but the development and the efficiency of editing the genome of zygotes may be affected by the sgRNA used for CRISPR/Cas9 system.     

Polymorphism of FGF14 Gene and Its Effect on Growth Traits in Yanbian Yellow Cattle

The purpose of this study was to explore the polymorphism of exon 3 of fibroblast growth factor 14 (FGF14) gene and its effect on growth traits in Yanbian Yellow cattle.The third exon of FGF14 gene was sequenced and analyzed by DNA direct sequencing method,and the genotyping of FGF14 gene was detected by HRM typing technique with high resolution melting curve,so as to explore the relationship between different genotypes of FGF14 gene and growth traits of 16 and 24 months of age in Yanbian Yellow cattle.The results showed that one A>G mutation was detected at position 631 947 bp of FGF14 gene,two alleles of A and G,and three genotypes of AA,AG,and GG.The results of χ² test showed that the distribution of genotype frequency and allele frequency of FGF14 gene in two Yanbian Yellow cattle populations of 16 and 24 months of age conformed to Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05).Polymorphic information content (PIC) analysis results showed that FGF14 gene was moderately polymorphic in both groups (0.25 < PIC < 0.5).The results of association analysis with growth traits showed that the different genotypes of FGF14 gene had significant influence on the traits of height at back and rump length of Yanbian Yellow cattle at 16 months of age (P<0.05),and had significant influence on the traits of body height,body weight and height at hip cross of Yanbian Yellow cattle at 24 months of age (P<0.05).In conclusion,it was speculated that FGF14 gene had a certain influence on the growth and development of Yanbian Yellow cattle,and provided reference for the subsequent modern molecular breeding and breeding of meat traits in Yanbian Yellow cattle.     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

PLCγ1基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响

旨在探究磷脂酶Cγ1（phospholipase Cgamma 1,PLCγ1）基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响,为揭示PLCγ1基因在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。本研究选取包裹3层以上颗粒细胞的绵羊卵母细胞为试验材料,体外培养成熟后将其分为两组,利用显微注射技术将PLCγ1基因导入MⅡ期（减数第二次分裂中期）卵母细胞（n=127）中为试验组,以显微注射空载体pcDNA3.1-EGFP作为对照组（n=120）,经48 h后统计其卵裂率;并利用Ca²⁺探针Rhod 2-AM监测MⅡ卵母细胞和显微注射后16、48、72、96、120 h时各时期卵母细胞以及早期胚胎内Ca²⁺波动。结果显示,PLCγ1基因显微注射后卵母细胞被激活,卵裂率为（（19.67±0.2）%,P<0.01）,桑椹胚发育率为（（9.00±0.17）%,P<0.05）;PLCγ1基因注射后,卵母细胞和早期胚胎不同发育时期有Ca²⁺浓度变化,可观察发现Ca²⁺主要分布在胞质中且注射48 h时可达到峰值（P<0.01）。结果表明,PLCγ1基因可以引起绵羊卵母细胞发育过程中发生Ca²⁺振荡,启动其卵裂,并促使早期胚胎的继续发育。