产角蛋白酶菌株的筛选、鉴定和发酵特性的初步研究

通过酪蛋白平板初筛,以羽毛为唯一的碳源与氮源复筛,筛选出一株新型的高产角蛋白酶的菌株S6,根据其形态观测结果和生理生化指标的测定结果,初步鉴定其属于地衣芽孢杆菌属。以羽毛为底物对地衣芽孢杆菌S6的发酵特性初步研究发现,在72 h,地衣芽孢杆菌S6酶活性、可溶性蛋白量达到最大,分别为186.8 U/mL,160.87 μg/mL,表明在降解羽毛的过程中,其具有很好的开发前景。     

鸡毛降解菌的分离鉴定

为了筛选降解鸡毛生产蛋白饲料的菌种,试验采用富集分离筛选法,从绍兴富盛山里养鸡场堆砌废羽毛土样中筛选鸡毛降解菌。采用测定发酵液可溶性蛋白和氨基酸含量的方法对分离菌进行复筛,并通过形态学、生理生化反应和16S rDNA测序,对降解能力最强的菌株进行鉴定。结果表明:从养鸡场堆砌废羽毛土样中分离得到11株鸡毛降解菌,CTC385-G8降解能力最强,鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌,说明CTC385-G8是良好的鸡毛降解菌。     

多西环素降解菌的筛选、鉴定及发酵培养基优化

为了筛选鉴定能高效降解多西环素的菌株,并对其发酵培养基进行优化,试验对长期受四环素类抗生素污染的鸡粪等样品进行菌株富集,采用与多西环素共培养的方法进行初筛,用抑菌圈法和高效液相色谱法测定降解效率进行复筛来筛选菌株;经16S rDNA序列分析对降解率最高菌株的种属关系进行初步判定;通过正交试验设计对该菌株进行发酵培养基的优化,并计算培养基优化前后的降解率。结果表明:筛选得到1株对多西环素降解率较高的革兰氏阳性菌株D1,降解率为43.31%。经16S rDNA序列分析初步判定该菌株为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。对D1进行发酵培养基的优化,优化结果为可溶性淀粉0.75%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.25%、pH为7.0,发酵培养时间为48 h。优化后的降解率达到69.55%,比优化前提高了26.24%。     

竹鼠肠道中厌氧纤维素降解菌的分离与鉴定

本试验旨在从竹鼠肠道中分离厌氧纤维素降解菌并鉴定。取中华竹鼠盲肠内容物稀释,采用含2种不同纤维素[微晶纤维素(MCC)和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)]的培养基在厌氧条件下对纤维素降解菌进行初筛,后又经以纤维二糖为唯一碳源的培养基的多次复筛,选出的菌株进行经形态学和分子生物学的鉴定。结果表明:经过初筛和复筛,筛选出了2株厌氧纤维素降解菌。初筛培养基采用MCC和CMC-Na最终筛选出的2株纤维素降解菌的纤维素酶活力分别为6.599和5.268U/m L。菌株经PCR鉴定、测序,用所得序列构建系统发育树,得出这2株菌与酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)具有很高的同源性,达99%,二者均属于梭菌属(Clostridium)。本试验从竹鼠盲肠中成功筛选出2株纤维素降解菌,经鉴定确定属于梭菌属。     

大熊猫粪便中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件的优化

本试验旨在从大熊猫粪便中筛选出能够降解纤维素的菌株,并对该菌株进行鉴定和产酶条件的优化。利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的培养基,结合碘液染色法、滤纸分解试验和纤维素酶活力测定,从大熊猫粪便中筛选得到1株纤维素降解菌DL。结合形态学观察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析,初步鉴定该菌株为Paenibacillus cookii LZ033,它是一种产芽孢且好氧的革兰氏阳性菌。为确定菌株DL的最佳产酶条件,选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素,在单因素试验结果的基础上,利用正交试验,确定菌株DL的最佳产酶条件为培养基初始pH为6、培养温度为35℃、摇床转速为125 r/min、250 mL三角瓶装液量为100 mL,在此条件下纤维素酶活力(以滤纸酶活力表示)为102.3 U/mL。     

纤维素降解菌的筛选、鉴定与产酶条件优化试验

为了筛选高效降解纤维素菌株,试验以朽木及其下面土壤为样本,筛选获得28株具有纤维素降解能力的菌株,采用刚果红染色和酶活性测定筛选出一株纤维素降解菌(LD03),通过形态观察、生理生化以及16S rDNA序列测定,初步鉴定该菌株属于Rhizobacter属细菌,对该菌株培养条件和产酶条件进行了优化。结果表明:菌株LD03最适产酶条件,碳源为30 g/L淀粉、氮源为3 g/L牛肉膏、初始p H值为7、培养温度为37℃、装液量为50 mL、接种量为4%、培养时间为36 h,酶反应p H值为7,酶反应温度为60℃。     

角蛋白降解菌分离、鉴定及其降解机制研究

实验旨在筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,并对其降解羽毛角蛋白机制进行研究,为提高角蛋白生物降解率提供理论指导。采用透明圈和完整羽毛降解相结合的方法,从废弃羽毛中筛选角蛋白降解菌,并进一步研究其羽毛角蛋白降解过程。获得一株可高效降解角蛋白菌株,基于形态观察和16S rDNA分子鉴定,该菌被命名为Bacillus licheniformis CP-7,其5 d可将天然完整羽毛完全降解。CP-7发酵过程产生大量巯基、可溶性蛋白和亚硫酸盐。分离发酵48 h菌株胞内、胞外粗酶液,发现胞外酶液具有较高的角蛋白酶活性,而胞内酶液具有一定二硫键还原酶活性。胞内酶液能够极显著地促进胞外酶液水解角蛋白活性(P<0.01),但对酪蛋白水解活性无影响(P>0.05)。筛选菌CP-7为具有高二硫键还原能力的角蛋白降解菌,二硫键还原酶可能是高效降解羽毛角蛋白的关键。     

玉米赤霉烯酮降解菌的分离、鉴定及其适宜降解条件的研究

试验旨在利用微生物降解法对饲料中存在的玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）进行快速、有效的消减。从不同地区采集了牛粪、羊粪及土壤样品共70份,并从中分离出164株菌株。利用环戊酮作为唯一碳源对这164株菌株进行初筛,再以ZEN作为唯一碳源对初筛菌株进行复筛并获得了8株ZEN降解菌株。采用高效液相色谱法（HPLC）对复筛得到的8株ZEN降解菌株进行ZEN降解率的测定,得到1株降解效果良好的菌株即NF-PJ-5号菌株。该菌株经16S rDNA序列比对、构建系统发育树、菌落形态观察及生理生化试验鉴定后确定为多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）。分别研究该菌株在不同温度、不同pH及不同菌液浓度条件下对ZEN的降解能力,评估菌株性质;同时,初步探究该菌株对ZEN的清除机理。结果显示,在28~32 ℃,pH 6.5~7.5,菌液浓度在2×10⁹ CFU/mL以上时,该菌株对ZEN保持较高的降解率。在30 ℃、pH 7.0、160 r/min培养48 h后,该菌株对初始浓度为10 μg/mL的ZEN降解率达到83%。综上,本试验筛选到1株ZEN降解能力较强的菌株,经鉴定为多食鞘氨醇杆菌。初步推测该菌株可通过产生胞外酶降解ZEN,同时该菌细胞壁对ZEN具有一定吸附能力。     

降解羽毛角蛋白制备小肽的丝状真菌的分离及筛选

采用富集分离筛选法,从长期堆积羽毛废弃物的8个土样中富集分离到8株能够在以羽毛粉为主要碳、硫以及氮源的固体培养基上产生透明蛋白溶解圈的细菌和2株真菌,经过2次摇瓶复筛,分别通过测定发酵液中可溶性蛋白的含量和肽键的水解度的变化,最后筛得1株能够有效将羽毛角蛋白水解成小肽和氨基酸的丝状真菌F2,结果表明:F2菌株在30℃,120r/min条件下,液态发酵羽毛粉,60h后发酵液中可溶性蛋白的含量可达到739.40mg/L,羽毛粉失重率达83.8%,水解度达到30.90%。     

一株蚕丝脱胶酶产生菌的筛选鉴定及产酶条件优化试验

从丝厂周边土壤中筛选到一株能高效生产脱胶酶的菌株。通过形态学观察和16S rDNA碱基序列测定及同源性分析,鉴定该菌株为革兰阳性杆状细菌,有芽孢,好氧且不具运动性,属于芽孢杆菌属(Bacillus)。对scw2-1菌株产脱胶酶发酵条件的优化结果是:培养基组分的最佳碳源为0.03 g/mL可溶性淀粉、氮源为0.03 g/mL大豆粉、金属离子为K+(0.01 g/mL KHPO),发酵最适温度为37℃,培养基初始pH值为10.0,发酵时间为72 h。     

无机磷细菌的筛选及其固体发酵研究

从实验室保存的83株芽胞杆菌中初筛出11株具有解无机磷能力的菌株,通过平板法进行初筛,根据溶磷圈直径和菌落直径比值大小筛选出溶磷圈直径和菌落直径比值较大的菌株3株,进一步通过液体摇瓶培养复筛出1株分解无机磷能力最强的菌株ZP。对筛选到的3株解无机磷能力强的菌株进行固体发酵培养,研究不同培养基配方及发酵时间与菌株解磷能力之间的关系,以期为生产解磷菌制剂提供理论依据。     

解磷根瘤菌液体培养基类型,浓度及透气条件的比较

以解磷根瘤菌SL01为供试菌株,采用液体培养研究了培养基类型和浓度以及透气状况对其生长的影响。结果表明:供试的培养基中,最适的液体种子培养基为LB和1/2 LB液体培养基,菌株的繁殖速度不仅与培养基的类型有关,更受到营养条件的限制;培养基接入解磷根瘤菌SL01并充分发酵之后,发酵液的pH值都相当程度的偏离了初始的酸碱度;根瘤菌作为好气菌,YMA液体培养基中培养12 h后,透气条件下发酵液内的活菌数达12.2×109cfu/mL,为密闭培养条件下的10.51倍,在解磷根瘤菌的发酵培养中,透气状况应作为重要的环节进行考虑。     

类植物乳杆菌L-ZS9培养基及培养条件的优化

类植物乳杆菌L-ZS9分离自发酵肉类食品,作为益生菌制剂和发酵剂在乳品行业具有良好的应用潜力。为实现类植物乳杆菌L-ZS9的高密度培养,以MRS培养基为基础进行培养基的优化,并优化培养条件。以单因素试验初步确定培养基中所用的碳源和氮源,通过Plackett-Burman试验确定出培养基成分与培养条件中影响较大的因素,经最陡爬坡试验确定各因素的水平,再通过响应面旋转中心组合试验拟合出菌体密度与因素水平间的方程,从而确定优化后的培养条件。结果表明：培养基中所用的碳源为蔗糖,氮源为酵母粉;经过验证实验得到的优化     

短芒大麦草青贮微生物特性研究及优良乳酸菌筛选

以短芒大麦草为研究对象,利用传统培养法从叶围和青贮发酵体系中分离出乳酸菌、大肠杆菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌,并计数;结合细菌形态学、生理生化特征及16S rDNA序列分析鉴定分离出的乳酸菌菌株;通过研究乳酸菌的生长曲线、产酸特性及耐酸性,筛选优质乳酸菌。以期探明短芒大麦草叶围及青贮发酵体系中微生物菌群特性及青贮料中乳酸菌多样性,筛选出具有促发酵效果的乳酸菌菌株,为有益微生物饲料研发奠定基础。试验结果表明,短芒大麦草经青贮发酵后各微生物菌群数量发生不同程度变化,乳酸菌数量由0 cfu/g FM增加到4.00×10⁸ cfu/g FM,酵母菌数量由8.50×10⁵ cfu/g FM增加到1.02×10⁸ cfu/g FM,而好氧细菌、大肠杆菌和霉菌数量变化不明显;从短芒大麦草青贮发酵体系分离得到4株乳酸菌,经鉴定Lx36为Lactobacillus pentosus,Lx37为Lactobacillus brevis,Lx53为Pediococcus pentosaceus,Lx54为Lactobacillus parabuchneri;筛选得到1株益于青贮的乳酸菌株Lx36,约在20 h后进入稳定生长期,OD值达到4.21,且发酵12 h的pH仅为4.08,并可以在pH=3.0环境条件下生长。综上所述,青贮发酵是体系中各种微生物相互作用的过程,微生物菌群的数量及变化直接影响青贮饲料发酵品质。短芒大麦草青贮饲料中乳酸菌种类较丰富,筛选得到的戊糖乳杆菌繁殖速度快、产酸能力强同时表现出了较强的耐酸性,具有潜在的生产应用价值,适宜用作促发酵的青贮添加剂菌种。     

α-淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育

从土样、水样和面样中分离产α-淀粉酶的芽胞杆菌,对3个样品进行淀粉平板分离和革兰氏染色、芽胞染色,选出产α-淀粉酶芽胞杆菌10株(土样4株、面样3株、水样3株).同时测得其水解圈直径与菌落直径的比值,均在1.9～2.6之间,通过产淀粉酶液体培养基发酵产酶,采用比色法测定发酵液中α-淀粉酶活力均在4.8～5.7 g/mL之间.以筛选出产酶活力较高的菌株为出发菌株,进行紫外线诱变选育,经过大量筛选得到优良菌株,在适宜条件下经过发酵其α-淀粉酶活力可达9.6～13.0g/mL,较出发菌株酶活力提高了69.9%～129.5%.     

蜡样芽孢杆菌与粪肠球菌协同发酵豆粕工艺条件优化

试验研究了不同发酵条件对发酵豆粕品质的影响,采用单因素优化,逐级递进法,对豆粕发酵条件进行了优化。以豆粕为原料,以益生蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌作为发酵菌种进行固态发酵试验研究,主要考察其对发酵产物酸溶蛋白和总有机酸的影响。结果表明,豆粕固体发酵最优工艺条件为:发酵菌种比2:1(蜡样芽孢杆菌菌液:粪肠球菌菌液=2:1)、发酵初始含水量45%,发酵时间54 h、好氧与厌氧时间比2:1,在此发酵条件下酸溶蛋白达到14.95%、总有机酸2.47%、抗原蛋白降解率在90%以上。     

枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的发酵工艺优化及培养基筛选的研究

研究旨在探索枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的最适发酵条件和最适培养基组成,以期提高发酵液中sublancin含量。试验先通过单因素试验筛选出最适发酵条件,确定发酵培养基需要的无机盐、碳源、氮源,再通过正交试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计的响应面分析方法确定最适发酵培养基组成。结果表明：枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的最适发酵条件为菌种接种量1.0%、发酵温度37℃、发酵液初始pH 7.0;最适发酵培养基为K₂HPO₄ 5 g/L、KH₂PO₄ 5 g/L、MgSO₄ 10 g/L、可溶性淀粉30.2 g/L、蛋白胨23.6 g/L、玉米浆18.2 g/L;优化后sublancin产量由756 μg/mL提到1 581 μg/mL,是优化前的2.09倍。综上所述,本研究所筛选的最适发酵条件和最适培养基可为枯草芽孢杆菌YT168-6菌株工业化生产sublancin提供技术参考。     

一株高产内切纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌的产酶条件优化及酶学性质分析

试验旨在对一株杜仲树皮内生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的内切纤维素酶(CMCase)进行产酶条件优化及酶学性质分析,为探究贝莱斯芽孢杆菌CMCase的相关特性提供参考依据。采用单因子试验设计,分别优化pH、接种量、温度、时间、碳源和氮源等发酵条件,并探讨温度、pH、底物专一性、金属离子及表面活性剂对CMCase的影响。结果表明,以玉米秸秆为碳源(30 g/L)、豆粕为氮源(30 g/L)、3%接菌量、pH 7.0的条件下37℃培养48 h,贝莱斯芽孢杆菌157的CMCase最高可达(5.14±0.18) U/mL。经CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157的最适酶反应温度为60℃,最适pH为5.0;温度稳定性试验发现,在40和50℃时,相对剩余酶活力均高于80%,随着温度的升高,酶活力逐渐降低,当温度高于55℃,相对剩余酶活力约为50%;pH稳定性试验发现,在pH 5.0～10.0之间耐受性良好,相对剩余酶活力均高于90%,随作用时间的延长,相对剩余酶活力变化不大。贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase属于典型内切型纤维素酶。Na^+、Mg²⁺、Ca²⁺可促进贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase酶活力,而Co²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和SDS抑制CMCase酶活力;表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100对贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase无影响。本试验通过对贝莱斯芽孢杆菌157进行产酶条件优化及CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase具有产酶量高,耐受pH范围广的特点,在饲料添加剂、洗涤剂和造纸领域中具有一定的应用价值。     

1株降解黄曲霉毒素B1的解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其体外脱毒效果

旨在筛选出能够高效降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的菌株,并对其脱毒活性组分的脱毒效果进行研究,本研究以香豆素为唯一碳源对目标细菌进行初筛,以对AFB₁的降解率为指标进行复筛,并从形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定;通过测定该菌株不同发酵组分对AFB₁的降解率,来定位其脱毒活性组分,同时采用CCK-8法测定活性组分降解AFB₁后对LMH细胞毒性,并研究了热处理、紫外线照射、强酸、强碱及蛋白酶K处理对活性组分脱毒作用的影响。结果显示,从样品中初筛分离到24株能够在初筛培养基生长良好的菌株,经复筛从中筛选到一株能高效降解AFB₁的菌株Y1-B1,其AFB₁降解率达到73.2%;经形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析确定该菌为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。对菌株Y1-B1培养物的不同组分进行的脱毒活性研究表明,不同组分对AFB₁的降解率不同,上清液的脱毒能力最强,细菌细胞裂解物的脱毒能力下降明显,菌体悬液和菌体裂解物上清的脱毒能力最差,由此确定解淀粉芽胞杆菌Y1-B1的脱毒能力主要来源于上清液中的某种活性物质;细胞毒性结果显示,与AFB₁对LMH细胞的毒性作用相比,AFB₁被上清液降解后其产物的毒性显著降低。该脱毒活性组分对不同理化因素处理呈现出不同的表现,对高温、紫外照射抵抗力较强,对强酸、强碱抵抗力较差,蛋白酶K仅造成脱毒能力部分减弱。本研究将为解决黄曲霉毒素污染问题提供新的微生物种质资源,同时为后续微生物脱毒制剂的开发奠定基础。