牦牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及鉴定

为提高牦牛乳腺上皮细胞体外培养成功率,实现高度可重复性,试验采用2.5 g/L(含0.5 g/L EDTA)胰酶和Ⅰ型胶原酶(1 mg/mL)分段消化牦牛乳腺组织块以分离细胞,原代培养时于DMEM/F12培养体系内添加氢化可的松(1 μg/mL)、表皮生长因子(50 ng/mL)及胰岛素-转铁蛋白-硒(5 μg/mL)...     

猪小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块培养法能够成功培养猪小肠上皮细胞并稳定传11代。2)本试验获得的猪小肠上皮细胞角蛋白18抗原鉴定为阳性,染色体核型为二倍体。3)倒置显微镜下观察培养至第11代的猪小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,呈现"铺路石"和上皮样形态。培养11代后的猪小肠上皮细胞间隙开始变大,规则不明显,细胞开始凋亡。第15代的猪小肠上皮细胞则出现大量凋亡并从瓶底脱落,仅有很少细胞贴壁生长。综上所述,采用组织块培养法能够获得生物学功能稳定的猪小肠上皮细胞系并能正常传11代,可为细胞的永生化提供试验素材。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及超微结构鉴定

通过组织贴块法取部分奶牛乳腺组织进行培养,并通过在培养基中添加适当浓度的营养因子以及控制消化时间将成纤维细胞去除,纯化出原代奶牛乳腺上皮细胞。通过免疫荧光鉴定,形态学观察,扫描电镜和透射电镜检测原代乳腺上皮细胞特性。观察结果显示,本试验分离培养的牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫荧光染色鉴定结果呈阳性。形态学观察及超微结构观察显示,试验所分离的上皮细胞呈鹅卵石样单层聚集,胞内有丰富的线粒体和内质网,细胞状态良好,传至15代以上细胞依然增殖旺盛,因此可以作为研究奶牛乳腺机能的重要工具。     

绵羊输卵管上皮细胞的分离与培养

通过建立输卵管上皮细胞的体外培养和传代的方法，进行形态学观察及冻存。取雌性绵羊输卵管上皮细胞，用胶原酶消化和不锈钢网过筛法分离输卵管内膜基质细胞和上皮细胞，进行单细胞原代及传代培养。在输卵管上皮细胞的培养可持续培养4-6周，传3-4代。原代培养细胞7d长成单层，传代细胞4d长成单层。该研究旨在建立一套输卵管上皮细胞体外培养和传代的方法，为进一步研究β-防御素在雌性生殖道的作用方面提供很好的研究模型。     

体外培养奶山羊乳腺上皮细胞的形态学观察

采用胶原酶和透明质酸酶组合消化法分离培养奶山羊乳腺上皮原代细胞,并通过胰蛋白酶和EDTA选择性消化法纯化奶山羊乳腺上皮细胞.建立了奶山羊乳腺上皮细胞系.显微镜下观察,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应.     

牦牛乳腺上皮细胞体外培养及鉴定

本研究旨在建立牦牛乳腺上皮细胞系,并对建立的细胞系生物学特性进行鉴定,采用组织块种植法,分离培养乳腺上皮细胞;通过胰酶消化法纯化细胞;利用免疫荧光及Western blot技术对其进行鉴定;脂质体介导法将绿色荧光蛋白基因转染进乳腺上皮细胞中,荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白基因表达;金黄色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮细胞,流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测乳腺上皮细胞的凋亡,RT-PCR检测感染细胞中抗菌肽以及凋亡因子表达。结果表明,分离纯化获得牦牛乳腺上皮细胞,细胞角蛋白18表达呈阳性,波形蛋白表达呈阴性,证明培养的细胞是上皮细胞并且没有成纤维细胞污染;β-酪蛋白表达呈阳性,说明建立的乳腺上皮细胞具有一定的泌乳功能;荧光显微镜能够检测到绿色荧光蛋白表达,表明EGFP基因成功导入了乳腺上皮细胞;金黄色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮细胞3h后,Annexin V/PI双染法检测发现感染组细胞凋亡率明显升高,差异显著(P0.05);感染细胞中TAP(P0.01)、BNBD5(P0.01)及BAX(P0.01)表达量明显增高,BCL-2(P0.05)表达量降低。综上表明,本研究成功建立了一株稳定的牦牛乳腺上皮细胞系,该细胞系能够作为研究牦牛乳腺发育及分化的体外研究模型。     

乳腺上皮细胞体外培养的研究进展

乳腺上皮细胞体外培养的成功对研究乳腺的生长发育、泌乳机制、乳腺肿瘤和癌变的发生及乳腺生物反应器的应用等方面的研究都有重要的意义。具体来说．体外培养建立的乳腺上皮细胞系可为克隆和转基因动物生产提供良好的核供体;分泌功能的乳腺上皮细胞系的建立为乳腺发育学、乳腺病理学、泌乳生物学研究提供细胞模型。本文综述了国内外在此领域的研究进展,对乳腺上皮细胞的体外培养技术进行了总结为相关领域的研究提供参考。     

鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法,本研究分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化,筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法,并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示,取鸡输卵管漏斗部,0.25%胰酶+0.02%EDTA联合消化15min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,在20%FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好。培养的细胞在24h时成团贴壁,48~60h明显增殖,呈圆形或多角形"铺路石样"的单层细胞生长,72h后细胞增殖速度减慢,可以维持至10d以上,且传代后细胞贴壁生长良好,经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞,为研究鸭源鸡杆菌对鸡输卵管细胞的侵袭特性提供了良好的体外研究模型。     

鸡贮精腺上皮细胞的分离及原代培养

试验旨在探讨稳定可靠的贮精腺上皮细胞分离及原代培养方法,为研究鸡贮精机理提供细胞模型。以鸡输卵管的子宫阴道交接部组织样为材料,采用酶消化法和组织块培养法分离培养母鸡贮精腺上皮细胞,观察母鸡贮精腺上皮细胞的培养情况,比较不同细胞培养方法获得贮精腺上皮细胞的生长情况。结果表明,用胶原酶或胰酶单独消化母鸡子宫阴道交接部组织,经100目过滤后获得的贮精腺上皮细胞24 h后可贴壁,但48～72 h后细胞死亡;用胶原酶Ⅺ(0.01 g/mL)与胰酶(0.25%)先后消化母鸡子宫阴道交接部组织后再经100目过滤获得的贮精腺上皮细胞贴壁性良好,24～48 h细胞出现明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,开始死亡;用组织块培养法7 d可获得鸡贮精腺上皮原代细胞,该细胞可传2～3代;用组织块培养法获得的细胞进行免疫组化试验,发现细胞表达贮精腺差异表达基因编码的NXPH1蛋白,该蛋白在培养细胞内的表达符合其分泌蛋白特性,表明组织块培养法所获细胞可用于后续研究。综上,用组织块培养法获得的鸡贮精腺上皮细胞可为研究母鸡贮精腺机制提供细胞模型。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及蛋白含量测定

为建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞系(BMEC),进一步研究乳腺上皮细胞体外蛋白的分泌情况,本试验首先采用组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,用胰蛋白酶纯化细胞,并运用SDS-PAGE进行鉴定。采用MTT分析细胞活力,瑞氏-吉姆萨染色法对细胞核进行分析,并测定细胞上清液中β-酪蛋白(β-CN)含量。结果显示:本试验成功培养出较纯化的奶牛乳腺上皮细胞;细胞生长曲线呈明显"S"型,用瑞氏-吉姆萨法染色细胞,细胞核形态多为卵圆形且呈现明显蓝紫色。原代乳腺上皮细胞可连续多次传代且未出现永生化,细胞呈单层贴壁生长,证明细胞活力良好;测定其β-CN含量为3.3 mg/L。     

肉用杂交犊牛小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

本试验旨在建立肉用杂交犊牛小肠上皮细胞分离培养和鉴定的方法,为研究犊牛小肠上皮细胞营养吸收、免疫调控及肠道屏障功能提供原代细胞培养模型。选用新生未吮乳的肉用杂交犊牛的空肠组织,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法对小肠上皮细胞进行分离,应用相差消化法和相差贴壁法对犊牛小肠上皮细胞进行纯化。通过细胞形态学观察、生长曲线、免疫荧光及染色体核型分析等方法来鉴定细胞。结果表明:1)应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法得到的犊牛小肠上皮细胞生长状况良好,经纯化后得到90%以上纯度的犊牛小肠上皮细胞,并稳定传代至10代以上; 2)犊牛小肠上皮细胞的生长曲线为"S"形,符合细胞增殖规律; 3)免疫荧光鉴定犊牛小肠上皮细胞特异性表达角蛋白13和绒毛蛋白; 4)透射电镜观察发现犊牛小肠上皮细胞边缘有微绒毛结构,细胞与细胞之间的紧密连接结构清晰可见; 5)染色体核型分析显示细胞内含有60条染色体,形态正常,呈二倍体核型。综上所述,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化及相差贴壁纯化成功得到犊牛小肠上皮细胞,为研究犊牛小肠上皮细胞营养物质吸收、免疫调控和肠道屏障功能提供了细胞素材。     

新生山羊小肠上皮细胞株的建立和鉴定

进行肠上皮细胞的分离培养是研究小肠功能、营养物质吸收机制及其调控的主要手段之一。本试验利用组织块培养法成功的建立了山羊小肠上皮细胞株。获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,24h内贴壁并发生分裂。纯化后按照0.8～0.9×104个/cm2的密度种植时,3～4d连成一片。倒置显微镜下观察培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,细胞角蛋白鉴定为阳性。采用组织块培养法可以获得具有增殖能力的山羊小肠上皮细胞,为研究IEC的生理病理等提供有用的实验模型。     

新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞.结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6～7 d明显增殖,10～12d汇合成单层.连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征.倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11～12代细胞发生变形,间隙增大.细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性.电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见.结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞.     

Isolation,Culture and Identification of Buffalo Mammary Epithelial Cells from Milk

This study was aimed to set up a simple, economic and pure method to culture and identify buffalo mammary epithelial cell in vitro, which were collected from the fresh milk. The milk was collected in the late lactation period of the high yield milk buffalo, then it was mixed with the PBS in the ratio of 2:1 and centrifugated. A few suspernatants and the pellets were resuspended with the PBS when the milk fat were decanted, then recntrifuged. The final pellets and 1 mL of suspernatants were seeded in petri dish without fat, respectively. The isolated cells were mammary epithelial cells which were identified by cell morphology, immunofluorescence, growth curve, cell viability and RT-PCR. The buffalo mammary epithelial cells were successfully isolated from both the pellets and supernatants. The cells and impurities were less in the supernatants than that in the pellets. The cells were cobblestone-like without fibroblasts and most in cell division. In the post-confluent culture, mammary epithelial cells formed dome structures and layer-separated growth. The cells expressed cytokeratin 18 was identified by immunofluorescence which was the marker of mammary cells. The cell growth curve and cell survival rate were measured. The results showed that the buffalo mammary epithelial cells were activity and easy to attach. The mammary epithelial cells were expressed of milk protein and milk fat related genes detected by RT-PCR. The buffalo mammary epithelial cell line were successfully isolated and identified from fresh milk, which estabilished foundation for the study of the mechanism of lactation, the amelioration of the quality of milk and the improvement of milk yield of buffalo.     

水牛乳汁中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定

试验旨在从水牛（Bubalus bubalis）乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞并对其进行鉴定,建立经济、便捷的水牛乳腺上皮细胞分离方法。通过无菌收集高产奶水牛泌乳后期乳汁,将其与PBS按2：1（V/V）混匀离心;去除上层乳脂,取带少量上清的沉淀,与PBS按上述比例混匀再次离心;将脂肪层去除干净,取沉淀上方1 mL上清及沉淀分别接种于细胞培养皿。通过细胞形态、免疫荧光、生长曲线测定、细胞接种活力、RT-PCR等对分离的细胞进行鉴定。结果表明,试验成功从水牛乳汁的上清和沉淀中分离获得了水牛乳腺上皮细胞,上清部分细胞和杂质较少;而沉淀部分则细胞和杂质较多。细胞呈典型鹅卵石样,无成纤维细胞,细胞活力好,多处于分裂期。当细胞增殖高度融合时,出现乳头状结构和分层生长现象。经免疫荧光鉴定,分离获得的水牛乳腺上皮细胞表达上皮细胞标志蛋白--细胞角蛋白18。水牛乳腺上皮细胞的生长曲线呈S型,符合一般生物学规律。细胞接种存活率的测定结果显示,细胞活力好、贴壁能力强。经RT-PCR检测,水牛乳腺上皮细胞表达乳蛋白及乳脂合成相关基因。从乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞并对其进行鉴定,成功建立了水牛乳汁分离乳腺上皮细胞的方法,为研究水牛泌乳机制、改善乳品质、提高产奶量奠定基础。     

原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养方法的改进

目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术,建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法,因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节,国内外所使用方法主要是酶消化法、组织块贴壁法和组织块消化贴壁法。本文旨对先前的方法进行改良,建立一种简便易行、培养周期短、细胞活性及形态良好的原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术。采用健康未孕奶牛子宫为试验材料,取下子宫内膜组织,加入5 mL含2%双抗、40%胰酶的DMEM/F12培养基,4 ℃消化12 h,再将组织移至25 cm²细胞培养瓶中贴壁培养。获得原代细胞后,应用角蛋白-18抗体对细胞进行免疫组化荧光鉴定,并对第3代细胞采用CCK-8法测定不同时间点的D_{450 nm}值,绘制细胞生长曲线。结果显示,培养至第8天,原代细胞基本铺满细胞培养瓶瓶底,有效地缩短了常规组织块贴壁法的周期。通过角蛋白-18免疫组化荧光鉴定,原代上皮细胞的阳性率可达98%以上,相比常规组织块贴壁法来说,纯度明显提高,省去了细胞纯化的操作步骤。细胞增殖状态,符合正常的分裂生长特性。试验结果表明将常规组织块贴壁法进行了优化改良,不仅缩短了培养周期,同时提高纯度,保持细胞活性,为原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术的改良提供一定的参考。     

酵母培养物水溶物对离体草鱼肠道黏膜细胞生长及细胞膜完整性的影响

本试验以酵母培养物水溶物为试验材料,添加于离体草鱼肠道黏膜细胞培养液中,研究酵母培养物水溶物在不同浓度、不同作用时间下对细胞生长及细胞膜完整性的影响。采用单因子试验设计,设1个对照组及5个酵母培养物水溶物组(YC-1~5组),各组均设96个重复,每个重复为1个培养孔。对照组的培养液中不添加酵母培养物水溶物,YC-1~5组的培养液中酵母培养物水溶物的浓度分别为10、25、50、100、200 mg/L。结果表明:培养液中添加50~200 mg/L酵母培养物水溶物对细胞形态无损伤,100~200 mg/L酵母培养物水溶物在添加后3 h时显著增强细胞活性(P<0.05),50 mg/L酵母培养物水溶物在添加后6 h时显著增强细胞活性(P<0.05)。与对照组相比,3 h时各酵母培养物水溶物组培养液中乳酶脱氢酶(LDH)活力均没有显著变化(P>0.05),6 h时YC-4、YC-5组显著降低(P<0.05),9 h时YC-3、YC-4、YC-5组显著降低(P<0.05),12 h时YC-2、YC-3、YC-4、YC-5组显著降低(P<0.05)。各时间点(3、6、9、12 h)各酵母培养物水溶物组培养液中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活力与对照组相比均没有显著变化(P>0.05),但在6~9 h时GPT活力均低于对照组。由此得出,培养液中添加10~200 mg/L酵母培养物水溶物能促进离体草鱼肠道黏膜细胞的生长,保护细胞膜的完整性,其发挥保护作用的适宜浓度为50~200 mg/L。     

大白鼠乳腺上皮细胞的体外培养与鉴定

 试验选取泌乳期大白鼠乳腺组织,采用机械剪切结合胰酶消化的方法,在体外进行乳腺上皮细胞原代分离培养及鉴定。结果成功培养出大鼠原代乳腺上皮细胞,经过角蛋白免疫组化鉴定染色后,呈现阳性反应。显微镜下观察,细胞呈鹅卵石样;经多次传代,细胞增殖仍然长势很好。