Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi （Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis） and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.     

BcMF3反义基因植物表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

根据编码白菜(Brassica rapa L. ssp. chinensis,syn B. campestris ssp. chinensis)果胶甲酯酶的BcMF3 基因cDNA 序列内部第1 343～1 797个碱基之间序列设计引物,从白菜花蕾cDNA中PCR扩增出455 bp的片段,把该片段作为反义基因连接至双元载体pBI12l上,得到了植物表达栽体pBI-B3,并用"三亲杂交"法导入农杆菌LBA4404菌株中,PCR扩增和酶切结果表明所构建的植物表达载体pBI-B3含有BcMF3 反义基因片断,并已导入了根癌农杆菌(Agrobacterinm tumefuciens)中;采用花序浸润法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后,播种筛选浸润植株的种子获得了5 株卡那霉素抗性植株,PCR 扩增证明BcMF3反义片段成功整合到拟南芥基因组中;转基因拟南芥子代(T2)的抗性分离符合孟德尔分离比例,表明外源基因是单一位点插入.     

棉花GhPME1和GhPME2基因的克隆及表达分析

本研究旨在对棉花来源的果胶甲酯酶基因进行克隆和功能分析。通过RACE技术克隆了2个棉花果胶甲酯酶基因的cDNA,命名为GhPME1和GhPME2。序列分析发现:GhPME1和GhPME2的最大开放阅读框分别为1 704和1 752bp,分别编码含有567和582个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构预测显示这2个蛋白结构相似,包含PMEI和Pectinesterase结构域。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示在陆地棉的纤维发育过程中,GhPME1和GhPME2的表达峰值分别在9和4DPA(开花后天数),然后依次降低。而在海岛棉纤维中,这2个基因的表达均呈现逐渐上升的趋势,表达峰值分别出现在开花后24和29DPA。GhPME1和GhPME2在海岛棉和陆地棉棉纤维中的表达差异初步证明该基因家族的功能可能与棉纤维品质相关。     

耳叶补血草花粉萌发及花粉管生长状况的荧光显微观察

[目的]耳叶补血草是蓝雪科补血草属的多年生草本植物,具有较高的生态、药用和观赏价值.但其结实率极低影响了种群的繁殖.[方法]通过野外观测、荧光染色等手段对其花部特征、花粉萌发及花粉管生长状况等进行研究,以探讨耳叶补血草在传粉、受精过程中影响种子形成的因素.[结果]耳叶补血草的单花寿命较短仅1d,开花和散粉都集中在早上;花柱5枚,柱头丝状,但柱头花粉数量少且自花粉滞溜严重.自然状况下,花粉落置在柱头上5h后开始萌发,10 h时花粉管长约为花柱长度的1/4,20 h时花粉管达到花柱的2/3处,25～30 h花粉管到达子房.异花授粉比自花授粉有着较高的花粉萌发率和花粉管生长速度.[结论]耳叶补血草较多的花柱数目并没有增强雌蕊的授粉能力.柱头较差的花粉粘着力、自花粉滞留严重,且挤占花柱通道而抑制异花粉的萌发和生长,成为耳叶补血草传粉受精方面影响结实的因素.     

甘蓝型油菜F3’H基因反义植物表达载体的构建

类黄酮3’-羟化酶(F3’H)是类黄酮途径中的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。通过PCR法扩增了甘蓝型油菜(Brassica napus L.)F3’H基因的一段特异保守片段F3’HA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了F3’H反义植物表达载体pCAMBIA2301-F3’HA,通过PCR鉴定和酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。为进一步研究F3’H基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和该基因的代谢调控网络奠定基础。     

蔗糖和矿质营养对榛子花粉离体萌发和花粉管生长的影响

为探讨榛子花粉活力及影响因素,研究了离体培养条件下蔗糖浓度对平欧杂交榛与平榛和矿质营养[钙（CaCl2）、硼（H3BO3）和镁（MgSO2）]对平欧杂交榛花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明：在20％蔗糖培养基上,平欧杂交榛和平榛花粉离体萌发和花粉管生长较好,萌发率和花粉管长度分别为：42．40％、30．16％和126．3μm、137．1μm。添加适当浓度的氯化钙可显著性提高杂交榛花粉萌发率,而硼酸和硫酸镁则不能,0．03％的氯化钙作用最大,萌发率达57．58％。添加适当浓度的氯化钙、硼酸和硫酸镁可显著性提高花粉管生长长度,最适宜浓度分别为0．03％、0．03％和0．06％,花粉管长度分别为：388．8μm、450．1μm和225．3μm,分别是对照的3．08、3．56和1．78倍。     

Ca2+与葱兰花粉萌发和花粉管生长的关系

采用离体花粉培养技术,研究了不同浓度Ca~(2 )对葱兰花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明:较低浓度的Ca~(2 )(1×10~(-3)～1×10~(-5)mol/L)对花粉的萌发有一定的促进作用,能较快的促进花粉管的伸长,其中以Ca~(2 )(10~(-3)mol/L)作用最明显;而高浓度的Ca~(2 )(10~(-1)～10~(-2) mol/L)则对其有一定的阻碍和抑制作用。     

化学和物理因素对兔眼越橘花粉萌发的影响

以5个兔眼越橘品种的花粉为试材,研究了温度、硼砂、硫酸锰、氯化钴、蔗糖和GA3等化学和物理因素对花粉萌发及花粉管生长的影响。结果表明:兔眼越橘品种间花粉的发芽率存在着明显差异;适宜的花粉萌发温度为25~28℃,温度过高或过低抑制发芽;GA3和硼砂、硫酸锰、氯化钴等化学物质可以影响花粉的萌发,但品种间反应差异很大。改善环境条件和化学处理是提高花粉萌发率的有效途径。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

3个薄壳山核桃无性系花粉活力与显微结构比较研究

以薄壳山核桃无性系5号、27号、35号花粉为试验材料,测定了不同处理方式、不同采摘时期和不同出粉次数下的花粉活力,同时利用扫描电子显微镜对其花粉形态进行了观测。结果表明,不同处理方式、不同采摘时间和不同出粉次数下收集的同一薄壳山核桃无性系花粉,其活力存在显著性差异(P<0.05)。3个无性系花粉极轴长(P)和赤道轴长(E)存在显著性差异(P<0.05),花粉粒形状均为扁球形,具有3个萌发孔,均匀分布在赤道面上;3个无性系花粉赤道面观均呈椭圆形,无性系5号和27号极面观呈近圆形,而无性系35号极面观呈近三角形;3个无性系花粉表面呈颗粒状纹饰,均匀分布着颗粒状的突起,表面纹饰差异不明显。通过研究薄壳山核桃花粉的超显微结构,可为薄壳山核桃品种的起源、演化以及种类间亲缘关系等提供孢粉学依据,为薄壳山核桃的新品种选育、杂交育种奠定初步基础。     

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。     

镉胁迫对伴矿景天细胞壁多糖果胶组分及其果胶甲酯酶的影响

为探究细胞壁果胶对Cd胁迫的响应机理,通过盆栽实验研究了不同镉（Cd）浓度（0、25、50、75、100、200 mg·kg^-1）对伴矿景天细胞壁果胶含量、果胶甲酯酶（PME）活性、细胞壁果胶半乳糖醛酸含量和Cd含量的影响。结果表明,随着Cd处理浓度的增加,伴矿景天地上部和根部细胞壁螯合态果胶、碱性果胶含量均在Cd处理浓度为100 mg·kg^-1时最大,且螯合态果胶含量表现为地上部>根部,碱性果胶含量表现为地上部<根部。地上部细胞壁PME活性和半乳糖醛酸含量在Cd处理浓度为25 mg·kg^-1时最大,与对照相比显著增加了 40.4%和 39.2%。Cd胁迫抑制了根部细胞壁 PME活性,Cd处理浓度为 75 mg·kg^-1时,伴矿景天地上部和根部 Cd含量最高,与对照相比分别显著增加了58.4倍和70.1倍;螯合态果胶含量和碱性果胶含量与植物Cd含量呈显著正相关;根部的细胞壁果胶半乳糖醛酸含量和螯合态果胶含量呈显著负相关（r=-0.880,P<0.05）。研究发现,伴矿景天通过调整细胞壁果胶半乳糖醛酸含量来改变果胶含量,以增强伴矿景天对Cd的吸收累积。     

PRRSV陕西分离株ORF3基因的克隆、序列分析及原核表达载体的构建

根据GenBank公布的PRRSVORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株ORF3基因,将其克隆入pGEM-T载体中,测序并进行序列分析。再将ORF3基因亚克隆入pET-32a中,构建原核表达载体。结果扩增到765 bp的PRRSV全长ORF3基因,序列分析结果表明,分离株与SY0608亲缘关系较近,而与CH-2、HB-2关系较远。重组原核表达质粒经酶切鉴定正确后命名为pET-GP3,为进一步研究GP3蛋白的原核表达、免疫特性、结构与功能奠定了基础。     

SOCS2真核表达载体的构建及在3T3 L1前体脂肪细胞中的表达

细胞因子信号抑制蛋白(SOCS)是细胞因子信号通路的重要负调控因子.构建SOCS2真核表达载体并转染3T3-L1前体脂肪细胞,为研究SOCS2对不同细胞因子调控脂代谢奠定基础.取小鼠皮下脂肪提总RNA进行RT-PCR,克隆获得pMDl8-SOCS2质粒载体,双酶切目的基因,并克隆至质粒载体pcDNA3.1,成功构建了重组质粒载体pcDNA3.1-SOCS2;重组质粒瞬时转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,RT-PCR和Westem blotting检测重组质粒转染组SOCS2核酸和蛋白表达,表达水平均显著高于对照组,为进一步研究SOCS2基因对不同细胞因子调控脂肪代谢提供基础.     

NELL1和FMO3基因mRNA在绵羊肝脏与脂肪组织中的表达

旨在探究不同营养水平及不同生长阶段脂尾型绵羊NELL1和FMO3基因mRNA的组织特异性表达模式。选择健康、体质量相近的9月龄滩羊、同羊、哈萨克羊和西藏羊(羯羊)各3只,活体采集尾部脂肪样品。选择健康4月龄滩羊112只随机分为4组,公母各半,每组4个重复,每个重复7只羊。根据体质量增加目标分为3个阶段:22~28kg,28~35kg,35~40kg,每个阶段各组分别饲喂不同营养水平的日粮。每个生长阶段结束时采集肝脏、肾周脂肪、尾脂、皮下脂肪的组织样品,提取样品总RNA,采用实时荧光定量PCR的方法分析NELL1和FMO3 mRNA的表达差异。结果表明,FMO3 mRNA在哈萨克羊尾脂中的表达量最高,在同羊、滩羊、西藏羊尾脂中依次下降,且差异显著;NELL1 mRNA在西藏羊尾脂中的表达量最高,在滩羊、同羊、哈萨克羊中的表达量依次下降;营养水平和月龄对尾脂和肝脏中NELL1和FMO3 mRNA的表达水平有显著影响,而对皮下脂肪和肾周脂肪中NELL1和FMO3 mRNA的表达影响不显著。表明FMO3mRNA的表达水平与脂肪沉积呈正相关,而NELL1 mRNA的表达水平与脂肪沉积呈负相关;NELL1与FMO3对绵羊尾脂和肝脏中的脂肪沉积起调控作用,为进一步揭示脂尾型绵羊体内脂肪沉积的调控机制提供理论基础。     

白菜雄性不育相关基因BcMF3和BcMF4的A9启动子的基因沉默植物表达载体的构建

以白菜(Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis)雄性不育相关基因BcMF3和BcMF4为沉默对象,利用绒毡层组织特异性的A9启动子,构建了反义RNA、RNA干涉和双价反义RNA植物表达载体。结果表明,经过一系列分子操作,获得了A9启动子和目的基因片段,并利用它们构建了5个基因沉默植物表达载体,可用于基因功能验证。     

Detection of Distorted Segregation in Genotype of Pollen Calli Derived from Hybrid F1 of Cultivated Rice （Oryza sativa L.） Using SSR Markers

S-a, S-b and S-c are three loci for F1 pollen sterility in cultivated rice （Oryza sativa L.）. Taichung 65 （T65） is all Sj/Sj at these three loci, while its F1 pollen sterile near-isogenic lines, TISL2 （S-b）, TISL4 （S-a） and TISL5 （S-c） is Sj/Sj according to their respective sterility locus. Using SSR molecular marker to detect the segregation of the allele Si and Sj in pollen calli population induced from different hybrid F1, which have different pollen sterility locus, showed that the segregation of allele Si and Sj was distorted. The distorted direction of pollen calli population in vitro was not the same as F2 population in vivo. The quantities of pollen callus carrying Sj were much more than that of carrying Siat S-a and S-c locus, the ratio of Si and Sj were 1：4.81 and 1：1.96 respectively. But the opposite tendency was observed at S-b locus, the ratio of Si and Sj being 1：0.35. At the same time, all these results were undisturbed by either culture medium or culture period.     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建与转化

内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸[18∶2(9,12)]转化为十八碳三烯酸[18∶3(9,12,15)]的关键酶。通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到LeFAD3的全长cDNA,基因全长为1 184bp,开放阅读框(ORF)为1 134bp,注册号为EU251190。将该基因正反向序列分别插入带有35S-CaMV启动子pBI121表达载体下游,获得正、反义表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化番茄,获得转基因番茄植株。     

拟南芥H3K27甲基转移酶CLF响应环境温度和参与温度形态建成研究

目的 探索拟南芥H3K27甲基转移酶CURLY LEAF(CLF)在温度形态建成中的作用。方法 在不同温度条件(22和16 ℃)下,对拟南芥Arabidopsis野生型Col-0和突变体clf-29进行表型分析和转录组分析,筛选差异表达基因。结果 在不同温度条件下,clf-29表现出显著的表型差异,相较于22 ℃,16 ℃时clf-29和Col-0的表型差异更小。转录组分析发现CLF的缺失会导致大量基因表达差异,并将其分为4种类型(仅在Col-0显著上调、下调,仅在clf-29突变体显著上调、下调),包含96个温度响应基因。结论 拟南芥表观遗传调控因子CLF响应环境温度,并参与温度形态建成。