大口黑鲈幼鱼低温耐受、耗氧率和窒息点研究

对大口黑鲈北方亚种（N）、佛罗里达亚种(F)及其正交子代（N♀×F♂）和反交子代（F♀×N♂）幼鱼的耐低温限度、耗氧率和窒息点进行了测定。结果表明：在驯化温度为20 ℃,降温速率为2 h/℃时,北方亚种的半致死低温最低为(3.10±0.17) ℃,佛罗里达亚种最高,为(5.05±0.21) ℃,正、反交子代介于两亲代群体之间,分别为(4.80±0.06) ℃和(4.20±0.17) ℃,对4种鱼的半致死低温进行单因素方差分析,显示4种大口黑鲈的半致死低温具有显著性差异（P<0.05）。采用封闭式流水装置测定大口黑鲈北方亚种、佛罗里达亚种及正反交子代的昼夜平均耗氧率分别为0.136 8 mg/(g·h)、0.1811mg/(g·h)、0.168 1mg/(g·h)和0.138 8 mg/(g·h),4个群体的昼夜平均耗氧率差异不明显。窒息点测定显示佛罗里达亚种的窒息点最高为0.4 mg/L,北方亚种的最低为0.33 mg/L,4个群体在窒息点上差异不显著（P>0.05）     

大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的同工酶分析

应用水平式淀粉凝胶电泳法,对2尾大口黑鲈的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、眼、脑和鳃等7种组织的12种同工酶及蛋白质进行了检测筛选的预试验。实验认为,肌肉和肝脏的电泳带清晰、可以判别个体基因型的同工酶有7种,分别为AAT、GPI、IDH、LDH、MDH、ME和PGM。依据筛选结果,检测了50尾大口黑鲈北方亚种和40尾佛罗里达亚种肌肉和肝脏组织的7种同工酶,共检测出13个基因座位。除AAT-I＊基因座位之外的12／~-基因座位上两个亚种群体内的个体间无变异,平均杂合度观察值硪和平均杂合度预期值He均为0。田H。J＋和MD￡卜j＋两个基因座位在两个亚种间有明显差异,佛罗里达亚种均具有＋a基因,北方亚种均具有书b基因,可以此鉴定两个亚种。两亚种群体间的肫遗传距为0．1823。     

中国养殖大口黑鲈的亚种分类地位探讨

采用形态学方法和微卫星特异分子标记两种方法鉴定了中国养殖大口黑鲈Micropterus salmoides的分类地位。结果表明:中国养殖大口黑鲈的侧线鳞为58⁶8片,肋骨数为15对,这与原产地大口黑鲈北方亚种较一致;选择鉴别两亚种的特异性微卫星标记(Mdo6、Msal21)对中国养殖大口黑鲈进行特异性扩增,并以原产地大口黑鲈佛罗里达亚种和大口黑鲈北方亚种样品作为对照,结果为中国养殖大口黑鲈的特异性扩增片段大小和原产地北方亚种扩增条带相同。综合形态学和分子标记两方面的结果,表明中国养殖大口黑鲈应属于大口黑鲈北方亚种Micropterus salmoides salmoides。     

中国养殖大口黑鲈的亚种分类地位探讨

采用形态学方法和微卫星特异分子标记两种方法鉴定了中国养殖大口黑鲈Micropterus salmoides的分类地位。结果表明：中国养殖大口黑鲈的侧线鳞为58～68片,肋骨数为15对,这与原产地大口黑鲈北方亚种较一致;选择鉴别两亚种的特异性微卫星标记（Md06、Msal21）对中国养殖大口黑鲈进行特异性扩增,并以原产地大口黑鲈佛罗里达亚种和大口黑鲈北方亚种样品作为对照,结果为中国养殖大口黑鲈的特异性扩增片段大小和原产地北方亚种扩增条带相同。综合形态学和分子标记两方面的结果,表明中国养殖大口黑鲈应属于大口黑鲈北方亚种Micropterus salmoides salmoides。     

大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种mtDNA COⅠ序列的分析

采用PCR技术对大口黑鲈Micropterus salmoides北方亚种(21尾)和佛罗里达亚种(19尾)的mtDNA COⅠ区段进行扩增,得到约1400 bp的扩增片段,经测序获得了碱基排列顺序清晰的1337 bp片段。北方亚种个体间没有变异,只检测到1种单倍型,与GenBank中大口黑鲈全序列(DQ536425)中的COⅠ区段相应部位比对,有5个碱基出现置换;佛罗里达亚种检测到5种单倍型,19个个体与本研究中的北方亚种比对,有41个碱基出现完全置换。将6种单倍型的序列提交GenBank后获得序列号为KF176376^KF176381,运用Mega 4.0软件计算两个亚种的碱基组成和碱基差异,北方亚种的单倍型多样性指数(H)、核苷酸多样性指数(Pi)和平均核苷酸差异性(k)均为0,佛罗里达亚种的H、Pi、k分别为0.784、0.003 42和4.573,两个亚种平均Kimura 2-parameter遗传距离为0.0351。研究表明,大口黑鲈佛罗里达亚种mtDNA COⅠ区段的遗传多样性高于北方亚种,该序列可作为鉴别两个亚种的DNA条形码。     

养殖大口黑鲈的遗传多样性分析

用RAPD技术分析了广东养殖大口黑鲈Micropterus salmoides 3个群体基因组DNA的多态性.结果表明:用12条随机引物对3个群体共88尾大口黑鲈的基因组DNA进行扩增,共获得了106个位点,平均每条随机引物扩增出8.8个位点;广州群体、顺德大良群体和顺德南水群体的多态位点比例分别为32.08%、33.02%和40.57%;Nei遗传多样性指数分别为0.1151、0.1176和0.1627;Shannon's遗传多样性指数分别为0.1708、0.1742和0.2378.这表明目前广东地区养殖大口黑鲈种质资源还具有一定的遗传多样性,但养殖群体的遗传多样性在降低,且具有不同程度的种质退化.     

养殖大口黑鲈的遗传多样性分析

用RAPD技术分析了广东养殖大口黑鲈Micropterus salmoides3个群体基因组DNA的多态性。结果表明:用12条随机引物对3个群体共88尾大口黑鲈的基因组DNA进行扩增,共获得了106个位点,平均每条随机引物扩增出8.8个位点;广州群体、顺德大良群体和顺德南水群体的多态位点比例分别为32.08%、33.02%和40.57%;Nei遗传多样性指数分别为0.1151、0.1176和0.1627;Shannon s遗传多样性指数分别为0.1708、0.1742和0.2378。这表明目前广东地区养殖大口黑鲈种质资源还具有一定的遗传多样性,但养殖群体的遗传多样性在降低,且具有不同程度的种质退化。     

3个不同地理群体大口黑鲈遗传多样性分析

用RAPD技术对广东省佛山地区、浙江省菱湖地区和江苏省吴江地区的养殖大口黑鲈3个群体进行群体遗传变异分析,结果表明,用17条随机引物对3个群体共90尾大口黑鲈的基因组DNA进行扩增,共获得123个位点,平均每条随机引物扩增出7.24个位点,多态位点比例为43.09％;佛山、菱湖、吴江养殖大口黑鲈群体内的相似系数为0.8699、0.8922、0.8780;Nei指数分别为0.1734、0.1165、0.1543;佛山与菱湖、菱湖与吴江、佛山与吴江群体间的遗传距离分别为0.1657、0.512、0.1366.这表明,3个群体都具有一定的遗传变异,其中佛山群体最高,菱湖群体最低;佛山和菱湖群体间的遗传距离最大,佛山与吴江群体的遗传距离最小,用MEGA4.0软件进行聚类分析,佛山与吴江群体首先聚在一起,后与菱湖群体聚在一起.     

大口黑鲈养殖群体遗传多样性的分析

用RAPD技术对养殖的大口黑鲈M icropterus salm oides群体的遗传多样性进行了分析,即用20个随机引物对30个个体的基因组DNA进行PCR扩增,共扩增出2790条DNA片段,平均每个个体扩增出93条带。在检测到的93个位点中,多态位点数为49个,占52.7%,标记的分子量为0.2~3kb。个体间最大的遗传距离为0.4533,最小的遗传距离为0,其中有27个样品间的遗传距离较小(0.16~0),部分样品之间的遗传距离为0;有3个样品的遗传距离较大,表明大口黑鲈间的相似度较高,遗传多样性较少,但也有少数变异个体。30个个体的平均遗传距离为0.0796±0.1265,与胭脂鱼、黄颡鱼、鳑鮍、鲢、草鱼等其它淡水鱼类相比,它们的遗传多样性水平相仿。     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RTPCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆了大口黑鲈（Micropterus salmoides）胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5′端非翻译区101 bp、3′端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明：推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%~94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%~62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。     

恩诺沙星在大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内代谢动力学研究

给大口黑鲈(Micropterus salmoides)连续5 d口服30 mg·kg^-1剂量(以体质量计)的恩诺沙星,利用液相色谱技术测定不同时间点大口黑鲈各组织中恩诺沙星的含量,建立药时曲线,探讨恩诺沙星在大口黑鲈体内的代谢动力学。结果表明:在(25±2)℃水温下,大口黑鲈血液、肌肉、肝脏中恩诺沙星的达峰时间均为4 h,吸收半衰期分别为0.998、2.176、1.892 h,消除半衰期分别为8.494、23.84、37.53 h,血液中的药时曲线下总面积为132.23 μg·mL^-1·h,肌肉和肝脏中的药时曲线下总面积分别为273.50、247.12 μg·g^-1·h。25 ℃下,恩诺沙星在大口黑鲈体内的建议休药期为15 d。     

大口黑鲈遗传连锁图谱的构建

采用AFLP技术结合＂拟测交＂策略,以大口黑鲈Micropterus salmoides选育家系作为亲本进行单对杂交产生的F1代家系为作图群体,初步构建了大口黑鲈雌、雄性遗传连锁图谱。结果表明：用64对AFLP引物组合对父母本和106个子代个体进行遗传分析,共得到398个分离标记。母本分离标记有189个,其中172个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记有209个,其中181个符合1∶1孟德尔分离标记。雌性框架图包括75个遗传标记,分布在21个连锁群中,有6个三联体,6个连锁对,标记间平均间隔为18.22cM,图谱总长度为983.8 cM;雄性框架图包括82个遗传标记,分布在22个连锁群中,有7个三联体,5个连锁对,标记间平均间隔为19.22 cM,图谱总长度为1153.2 cM。雌、雄性基因组估算长度分别为1 399.85和1 582.72,图谱的总覆盖率分别达到70.28%和72.86%。     

MS-222在加州鲈鱼模拟运输中的麻醉效果

研究了加州鲈鱼(Micropterus salmoides)在10、20、30、40、50、60和70 mg/L的MS-222麻醉液中的麻醉效果,并在20 mg/L的MS-222麻醉液中研究了10、15、20和25℃水温对麻醉效果的影响,最后在20℃和20 mg/L的MS-222麻醉液中进行了麻醉模拟运输试验。麻醉试验结果表明:随着MS-222浓度的增加,进入相同麻醉期的时间缩短,完全复苏的时间延长。10~20 mg/L的MS-222适于加州鲈鱼的麻醉运输。麻醉时间随着水温的降低而缩短,复苏时间随着水温的降低而增加。20~25℃水温适于加州鲈鱼的麻醉运输。麻醉模拟运输试验结果表明:运输17 h存活率100%,运输24 h存活率降到70%。麻醉的鱼复苏时间随运输时间的增加而增加。麻醉运输后,肌肉中糖元含量下降,乳酸含量上升。血清皮质醇变化差异不显著但都显著高于基础组(P0.05)。天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素(UREA)、乳酸脱氢酶(LDH)在运输前10 h差异不显著之后显著升高(P0.05),葡萄糖(GLU)随运输时间的增加而增加。     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGFI基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点。应用RFLP、CRS—RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布。结果表明：（1）IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1317bp、712bp和1941bp;（2）在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G—A突变;内含子3的第40个碱基为一个“A”的插入-缺失突变,第307位为C—T突变,683位是G—A突变;内含子4上的696碱基处有一个20bp的插入-缺失突变,在1563位为G—A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;（3）内含子1上SNPG1070A的A等位基因能为HindIII限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型。根据内含子1上SNPG208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成TaqI酶切位点,建立CRS—RFLP检测方法。内含子4上SNPG1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型。试验结果显示,RFLP、CRS—RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;（4）在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNPG1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低。     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGF-I基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点.应用RFLP、CRS-RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布.结果表明:(1)IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1 317 bp、712 bp和1 941 bp;(2)在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G-A突变;内含子3的第40个碱基为一个 "A" 的插入-缺失突变,第307位为C-T突变,683位是G-A突变;内含子4上的696碱基处有一个20 bp的插入-缺失突变,在1 563位为G-A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;(3)内含子1上SNP G1070A的A等位基因能为Hind III限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型.根据内含子1上SNP G208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成Taq I酶切位点,建立CRS-RFLP检测方法.内含子4上SNP G1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型.试验结果显示,RFLP、CRS-RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;(4)在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNP G1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低.     

饲料中添加植酸酶对大口黑鲈生长和消化酶活性的影响

用添加不同水平植酸酶（0、500、1 000、1 500 U/kg）的饲料喂养初始体重为23 g左右的大口黑鲈Micropterus salmoides56 d,研究植酸酶对大口黑鲈生长和消化酶活性的影响。结果显示：饲料中添加1 000U/kg植酸酶能显著促进大口黑鲈的生长,降低饲料系数（P〈0.05）。1 000、1 500 U/kg组大口黑鲈胃蛋白酶活性较对照组分别提高了28.14%和20.09%,差异显著（P〈0.05）;各处理组鱼幽门盲囊中蛋白酶活力与对照组相比差异显著（P〈0.05）,而肠道中蛋白酶活性差异不显著（P〉0.05）。与对照组相比,各处理组鱼肝胰脏和肠淀粉酶活性有所提高,但差异不显著（P〉0.05）;1 000、1 500 U/kg组大口黑鲈的胃淀粉酶活性有所降低,但差异不显著（P〉0.05）。     

日本鲺(Argulus japonicus)寄生大口黑鲈的首次报道及分子系统发育研究

通过形态学和分子生物学的方法对1种寄生于大口黑鲈体表的鲺(Argulus sp.)进行鉴定,并根据SSU rDNA序列探究鲺属内物种的系统发育关系。结果显示:鲺体呈淡黄色;雌性体长1.93±0.46(1.42～2.54) mm,雄性体长2.18±0.49(1.57～2.87) mm;背甲马蹄形,侧叶末端伸达第三游泳足后缘;吸盘由多条(雌性:44～52;雄性:46～47)几丁质条组成,每条几丁质条含不等数量(雌性:5～6;雄性:7～8)的几丁质片。形态学与形态测量学结果与日本鲺(Argulus japonicus Thiele, 1900)最为相似。比对该物种SSU rDNA序列发现与日本鲺JN558647的序列相似性高达99.77%(1 274/1 277),进一步支持鉴定为日本鲺。ML系统进化树显示:鲺属内物种主要分为3个进化支;其中,日本鲺株系多位于Clade I中且与A.foliaceus和A.rhipidiophorus呈并系类群;本次采集的日本鲺(MW866569)聚于Clade I的基部,与日本鲺KF747859和KF747860株系亲缘关系最近。     

大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法的建立

为同时检测患病大口黑鲈中不同属虹彩病毒感染和带毒情况,针对蛙病毒属和肿大细胞病毒属大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白（major capsid protein,MCP）基因的序列,分别设计1对特异性引物Rana-mcp F/R和Mega-mcp F/R,扩增产物片段大小分别为475 bp和262 bp。通过PCR反应体系的优化、反应的特异性和灵敏度试验,建立一种可以同时检测大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属虹彩病毒感染的双重PCR检测方法,最低DNA检测量分别为6.5 pg和14.5 pg。用此方法,对临床获得的15个大口黑鲈样品进行双重PCR检测和序列测定,获得5个蛙病毒属和1个肿大细胞病毒属虹彩病毒检测阳性结果。本研究中建立的基于MCP基因的大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法,可用于养殖大口黑鲈虹彩病毒病快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

维生素C对大口黑鲈生长与非特异性免疫的影响

用添加不同剂量维生素C(分别为0、0.5、1、2、4 g/kg)的饲料喂养初始体重为19 g左右的大口黑鲈Micropterus salmoides 2个月,研究维生素C对大口黑鲈生长及非特异性免疫的影响.结果显示:饲料中添加维生素C＞1 g/kg,能显著促进大口黑鲈的生长,提高其脾体指数(P＜0.05),然而对大口黑鲈的饲料系数、成活率、肥满度、内脏比指数以及肝体指数等的影响均不显著(P＞0.05);试验前50 d,饲料中添加维生素C能显著提高大口黑鲈血清中溶菌酶的活力(P＜0.05),第60 d,饲料中添加维生素C为2g/kg以上时,能显著提高大口黑鲈血清中溶菌酶活力(P＜0.05);试验前30 d,饲料中添加维生素C能显著提高大口黑鲈血清中超氧化物歧化酶活力(P＜0.05),后30 d大口黑鲈血清中超氧化物歧化酶活力下降;随着饲料中维生素C添加水平的提高,大口黑鲈肝脏中维生素C的积累量显著升高(P＜0.05).试验证明,维生素C能有效地提高大口黑鲈的生长与非特异性免疫能力.