国槐SSR-PCR反应体系的建立与优化

利用单因素试验结合L₁₆（4⁵）正交试验设计对国槐SSR-PCR反应体系中的5个主要影响因素(Mg²⁺、引物、dNTPs、ExTaq酶、模板DNA用量)进行优化,确定最佳反应体系为（10μL）:25 mmol/L Mg²⁺1.0μL,2.5 mmol/L dNTPs 0.2μL,10μmol/L上下游引物共0.5μL,5 U/μL ExTaq酶0.05μL,30 ng/μL模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,ddH₂O 6.25μL。随机挑选4对SSR引物和8个国槐种质对试验确定的最佳反应体系进行验证,均能获得清晰、稳定的条带。该优化反应体系的建立为利用SSR标记对国槐种质资源进行深入研究和利用奠定了基础。     

黄瓜SSR-PCR反应体系的优化

采用L9(34)正交试验设计,研究了黄瓜SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并比较了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明,最适反应体系为:在20μL体系中包括dNTP 200μmol.L-1、Primer 0.4μmol.L-1、Mg2+2.5μmol.L-1、Taq酶0.5μmol和模板DNA60 ng。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物结果更准确。     

叶子花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化叶子花SSR-PCR体系。[方法]以乔木叶子花为材料,通过Touchdown PCR扩增程序和正交试验,对影响叶子花SSR-PCR体系的引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度和d NTPs浓度进行优化。[结果]叶子花20μl SSR-PCR体系的最优条件为引物浓度0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+浓度1.5 mmol/L、4种d NTPs浓度均为0.15 mmol/L,模板100 ng左右。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于后续叶子花遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究。     

药用植物苦参SSR-PCR体系的优化与验证

为有效利用SSR-PCR技术对药用植物苦参进行遗传多样性分析,采用正交设计L16(45)对影响苦参SSRPCR体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,PCR结果用DPS数据处理软件分析,筛选出各因素的最佳水平,建立适宜苦参SSR-PCR的反应体系和扩增程序,并选用内蒙古苦参对该体系进行稳定性验证。结果表明:在10μL的苦参SSR-PCR体系中,模板DNA的用量为20.0ng,Taq DNA聚合酶的用量为0.2~0.6U,Mg2+的浓度为2.5mmol/L,dNTPs浓度为0.1mmol/L,引物的浓度为0.6μmol/L。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性1min,56℃退火45s,72℃1min,35个循环;72℃延伸10min。4℃保存。选用12份苦参DNA对该体系进行稳定性验证,该体系具有较高的扩增稳定性,可用于药用植物苦参SSR标记的研究。     

油松SSR-PCR引物筛选及反应体系的建立

油松是我国特有的重要乡土针叶树种,开发合适的油松PCR-SSR引物并建立优化的反应体系,是开展油松天然群体和种子园人工群体遗传研究的基础.该研究以油松总DNA为材料,分析了Taq聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对PCR SSR扩增结果的影响,筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物12对,建立了稳定的、可重复的油松PCR-SSR最佳反应体系及PCR扩增参数.研究结果表明:在15 μL SSR -PCR反应体系中,样本最适宜浓度为30 ng,Mg2+的最适浓度为0.25 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为250 nmol/L;Taq聚合酶在15 μL反应体系中宜加入0.375 U.统计利用所选12对引物,对辽宁兴城油松种子园内49个建园无性系进行了SSR-PCR反应,通过6%的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,每对引物扩增产物在100～250 bp之间的等位谱带数最大为10,最小为5,不同无性系间DNA谱带多态性丰富.油松SSR-PCR引物筛选及反应体系的建立,为今后利用SSR标记技术开展油松种子园的父本分析及选择性受精研究提供了一个标准化程序和强有力的工具.      

正交设计优化番茄基因组DNA SSR-PCR反应体系

以21份番茄品种为材料,应用正交试验设计对影响番茄SSR—PCR的主要参数进行优化,建立适于番茄的SSR反应体系和扩增程序。在15μl体系中各反应的最适合含量为：2．5μl ddH2O,1μl 40ng模板DNA,3μl 200μmol／L dNTP,3μl 0．8μmol／L SSR引物,0．1μl 0．5U／μl Taq DNA聚合酶,1．5μl 10×PCR Buffer,0．9μl 1．5mmol／L MgCl2。PCR适宜扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性1min,45℃退火25s,共35个循环;68℃延伸25s,68℃延伸10min,然后4℃保存。利用此反应体系对21个番茄品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合番茄的遗传多样性研究。     

梁山慈竹SSR-PCR体系的优化

以梁山慈竹为材料,提取叶片DNA并将其作为模板,采用正交设计试验优化影响梁山慈竹简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)体系的3个主要因素,并对21个梁山慈竹不同品系进行稳定性验证,结果表明,优化的20μL SSR-PCR反应体系为2×Taq PCRMix 8μL、模板DNA(20 ng/μL) 2.5μL、SSR引物(1.0×10~(-4) mmol/L) 1μL,无菌蒸馏水补足至20μL;使用SSR引物BMK.38757对21个梁山慈竹不同品系进行扩增,扩增产物大小在140 bp左右,共有4个多态性位点;使用SSR引物L6、R83对梁山慈竹进行扩增,均获得3个多态性位点,且条带清晰。     

水稻SSR-PCR反应体系的优化

[目的]为了探索水稻最佳SSR—PCR反应体系。[方法]以水稻R117为试验材料,研究Mg^2＋、dNTP、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量以及退火温度对水稻SSR—PCR扩增结果的影响。[结果]当Mg^2＋浓度2．00mmol／L,dNTP浓度O．15mmol／L,引物浓度0．30μmol／L,TaqDNA聚合酶用量2．0U,退火温度56．6℃时,PCR扩增DNA条带最亮。[结论]在20山反应体系中,上述结果为水稻最适SSR—PCR反应体系。     

利用正交设计优化亚麻SRAP-PCR反应体系

为亚麻分子标记及分子育种提供可靠的理论依据,利用正交试验设计对亚麻SRAP-PCR反应体系中的4因素(模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度)在3个水平上进行正交优化,确立了适合亚麻SRAP-PCR反应的20μL体系:75ng模板DNA、0.75μmol.L-1引物、1.5mmol.L-1 Mg2+、0.40mmol.L-1dNTPs和1.5UTaqDNA聚合酶。     

油茶SSR-PCR反应体系建立与优化

油茶是我国特有的木本食用油料树种,本研究采用正交试验和单因素试验,建立并优化了油茶SSR-PCR反应体系。结果表明,油茶最适SSR-PCR反应体系为模板DNA(5~10 ng.μL-1)1.0μL,Mg2+(25 mmol.L-1)0.7μL,dNTP(10 mmol.L-1)0.15μL,正反向引物均为(10μmol.L-1)0.2μL,Taq DNA聚合酶(5 U.μL-1)0.1μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC水6.65μL,总体积10.0μL;同时证明了微卫星位点在山茶属(Camellia L.)植物的种间通用性。研究结果将为油茶遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析以及重要农艺性状的QTL研究提供重要的理论依据和技术支持。     

泡桐SSR分子标记反应体系的建立

以健康毛泡桐二倍体为材料,通过对影响SSR扩增效果的泡桐DNA,dNTP和引物浓度,Taq酶量及退火温度等因素的筛选,建立了适宜的泡桐SSR分子标记反应体系.结果表明,泡桐的适宜SSR分子标记反应体系中,退火温度为53℃,泡桐DNA质量浓度为0.05 mg·L-1,dNTP和引物浓度分别为0.1 mmol·L-1和0.3μmol·L-1,而Taq酶量和10×Taq酶缓冲液则为0.025 U·μL-1和2.0 mmol·L-1.     

蜡梅SSR反应体系建立及引物筛选

以素心蜡梅为材料,分别通过对影响蜡梅SSR扩增效果的模板DNA,dNTP,引物浓度,Taq酶和退火温度等因素的筛选,建立了其适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系,同时筛选了适宜蜡梅SSR扩增引物.结果表明,蜡梅SSR扩增的适宜退火温度为55 ℃,在20μL反应体系中,蜡梅模板DNA质量浓度、dNTP引物浓度分别为5mg·L...     

杜仲SSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为了对杜仲种质资源的遗传多样性研究奠定理论和技术基础,采用正交试验设计和单因素分析,建立并优化了杜仲的SSR-PCR反应体系。结果表明,杜仲SSR-PCR最适反应体系为正反向引物(10μmol.L-1)各0.2μL,Taq DNA聚合酶(5 U.μL-1)0.1μL,dNTP(10 mmol.L-1)0.2μL,模板DNA(5～10 ng.μL-1)1.0μL,Mg2+(25 mmol.L-1)0.6μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC超纯水6.7μL,总体积10.0μL。同时筛选出了3对多态性有效引物,研究结果证明了微卫星引物在不同物种间的通用性受物种间亲缘关系远近的影响,并初步揭示了杜仲的遗传多样性,表明了微卫星标记在遗传多样性研究上的优越性。     

小麦基因组SSR体系及反应条件优化研究

以小麦叶锈病抗病亲本TcLr45和感病亲本Thatcher为材料,探索影响SSR扩增结果的各因素(模板DNA、dNTP、引物、Taq酶)的最佳用量及不同引物的退火温度。结果表明:dNTP对扩增影响较大,Taq酶浓度在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时表现对扩增有一定影响,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合小麦SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为25μL,其中模板DNA 20~50 ngd、NTP 240μmol/L、引物各0.2μmol/L、Taq酶1.5 U。     

半矮生桃基因组DNA的提取及SSR-PCR反应体系的优化

为获得高纯度高质量的DNA和建立稳定的SSR-PCR反应体系,采用常规CTAB法和改进CTAB法提取半矮生桃基因组DNA。结果表明:改良CTAB法提取的DNA纯度高,多糖和蛋白质含量低,可用于SSR反应。同时,通过对影响SSR反应的6个要素设计正交试验,确定了最优的SSR-PCR反应体系,20μL反应体系为:25 mmol/LMg2+1.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5 U的Taq酶0.22μL、10×Buffer缓冲液4μL、10 mmol/L引物0.6μL、20 ng模板0.8μL,优化的退火温度为57.6℃。     

西蓝薹RAPD-PCR反应体系的建立与优化

以新型蔬菜西蓝薹为研究对象,采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,筛选了Taq酶、引物、DNA模板、Mg2+、dNTPs的浓度或用量,建立了西蓝薹RAPD-PCR的最佳反应体系:25 μL反应体系中含0.8 U Taq酶、0.40 μmol/L引物、30 ng DNA模板、1.6 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×PCR buffer.利用优化的反应体系,对5个西蓝薹品种进行体系稳定性检测,结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好.     

南瓜AFLP反应体系的建立与优化

以印度南瓜矮生等基因系yd为材料,从叶片中提取基因组DNA,对酶切、连接、预扩、选扩反应体系及银染方法进行优化研究,建立高效稳定的南瓜AFLP反应体系,即反应体系为DNA模板量500 ng、37C酶节5 h、连接3 h、预扩产物稀释50倍及Mg2+1.5 mmoL/L、dNTP 0.19 mmoL/L的效果最好.