重组CYP3A46细胞微粒体体外药物 代谢动力学分析

通过对巴马小型猪CYP3A46 重组细胞微粒体体外药物代谢动力学特征比较分析,为巴马小型猪应用 于临床前药理试验提供科学依据。分析重组CYP3A4、CYP3A46 细胞微粒体药物代谢动力学参数Vmax、Km(S50）、 Clint 及IC50 均表明：CYP3A46 的硝苯地平、睾酮的代谢活性及酮康唑的抑制活性均比较接近CYP3A4(P>0.05）, CYP3A46 是否是CYP3A4 的同源酶需要进一步研究确定。     

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其表达水平的影响

[目的]研究辛硫磷暴露对鲫鱼肝微粒体中细胞色素P4501a(CYP1A)活性及其mRNA和蛋白表达的影响,明确其剂量—效应及时间—效应关系,为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据.[方法]设辛硫磷低、中、高浓度组(0.0825、0.165和0.33 mg/L)和丙酮(助溶剂)对照组,采用半静态染毒法染毒鲫鱼,分别于染毒24、48、72和96 h后取样并迅速剖解取出鲫鱼肝胰脏,以CYP1A相关酶7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)活性反映CYP1A活性,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达情况.[结果]辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用,辛硫磷染毒24 h时CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系;各辛硫磷浓度组间均存在明显的时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%,且差异极显著(P<0.01,下同).辛硫磷染毒后,鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势,各染毒时间组间均存在较强的剂量—效应关系,除染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关外,其他染毒时间点均呈负相关.辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平,且呈明显的剂量—效应及时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组的表达量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%.[结论]辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响,其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显.     

洛克沙胂对猪肝微粒体CYP3A4及CYP2E1蛋白的影响

洛克沙胂是一种常用的饲料添加药物,细胞色素P450酶系(CYP或P450)是动物体内药物代谢的主要酶类。本文研究了洛克沙胂对猪肝微粒体P450酶系中的2种酶CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达的影响,为揭示该药的代谢机理、残留机制以及临床安全用药提供理论依据。实验将洛克沙胂以5、25和125mmol/L 3个剂量,分别添加到猪肝微粒体体外孵育体系中,以生理盐水作对照,于37℃孵育1h,测定微粒体蛋白含量及CYP3A4及2E1的蛋白表达。结果表明中剂量和高剂量的洛克沙胂对猪肝细胞微粒体的CYP3A4及2E1的蛋白表达均呈现抑制作用,而低剂量的洛克沙胂对CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达影响很小。     

马度米星铵对鲫鱼肝脏细胞色素P450酶系的影响

[目的]本文旨在研究鲫鱼肝脏细胞色素P450酶系对马度米星铵的响应。[方法]采用半静态染毒法,分别设置0.112、0.224和0.448 mg·L~(-1)马度米星铵处理组和助溶剂对照组,在染毒后7、14、21和28 d,测定肝脏中细胞色素P450 1A(CYP1A)、3A(CYP3A)及4T(CYP4T)基因mRNA表达水平,同时测定7-乙氧基异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)、氨基比林-N-脱甲基酶(APND)、苯胺-4-羟化酶(AH)、红霉素-N-脱甲基酶(ERND)、NADPH-细胞色素C还原酶(NCCR)的活性及细胞色素P450(CYP450)的含量;通过体外肝微粒体孵育法评价马度米星铵对CYP1A活性的影响。[结果]马度米星铵对CYP1A、CYP3A和CYP4T mRNA表达水平有一定诱导作用;0.448 mg·L~(-1)马度米星铵组CYP450含量在染毒后14 d显著低于对照组(P0.05);0.224和0.448 mg·L~(-1)马度米星铵组APND和NCCR活性在染毒后14 d显著低于对照组(P0.05);0.224和0.448 mg·L~(-1)马度米星铵组EROD活性在染毒后14和21 d显著低于对照组(P0.05);试验期间,马度米星铵组ERND活性均低于对照组;各染毒组的AH活性呈先升高后降低的趋势;体外肝微粒体孵育体系中,马度米星铵对CYP1A活性的抑制作用小于25%。[结论]马度米星铵对鲫鱼肝微粒体CYP1A活性无影响;马度米星铵对ERND活性的抑制作用可能与CYP3A的转录水平无关;ERND对马度米星铵较为敏感,适合作为马度米星铵污染水体的生物标志物。     

苯巴比妥对鸡肝微粒体CYP450活性的影响

选取40日龄依莎公鸡40只,随机分为2组,每组20只。对照组:每日腹腔注射生理盐水4 mL/kg,PB组:每日腹腔注射苯巴比妥80 mg/kg。连续处理5 d后,进行体外肝微粒体酶活性测定和体内探针药物安替比林(AP)消除动力学试验。结果表明,PB组的肝脏指数、肝微粒体蛋白含量和细胞色素P450含量、氨基比林-N-脱甲基酶(AND)、红霉素-N-脱甲基酶(ERND)和苯胺羟化酶(AH)的活性均极显著高于对照组(P<0.01),安替比林消除速率明显快于对照组。苯巴比妥对鸡肝微粒体CYP450具有明显诱导作用。     

草鱼肝细胞系中CYP3A活性检测方法

红霉素-N-脱甲基酶（ERND）是细胞色素P450 3A（CYP3A）依赖的酶类,可通过测定该酶催化代谢产物甲醛的量来反映其活性,从而评价CYP3A活性的高低。以草鱼肝细胞系（GCL）为模型,红霉素为底物,采用Nash比色法检测ERND产物甲醛含量,Lowry比色法测定细胞蛋白含量,建立鱼类细胞中CYP3A活性的简便检测方法。研究表明,底物以0.4 mmol/L作用60 m in后进行检测较为合适。细胞样品中ERND产物甲醛平均回收率为78.80%±4.37%,平均日内精密度为2.80%±1.40%,平均日间精密度为3.91%±1.45%,通过计算探针酶ERND活性可为鱼类细胞CYP3A活性的评价提供简便可靠的方法,从而为鱼类药物代谢酶体外诱导模型的研究奠定了基础。     

草鱼肝细胞系中CYP3A活性检测方法

红霉素-N-脱甲基酶（ERND）是细胞色素P450 3A（CYP3A）依赖的酶类,可通过测定该酶催化代谢产物甲醛的量来反映其活性,从而评价CYP3A活性的高低。以草鱼肝细胞系（GCL）为模型,红霉素为底物,采用Nash比色法检测ERND产物甲醛含量,Lowry比色法测定细胞蛋白含量,建立鱼类细胞中CYP3A活性的简便检测方法。研究表明,底物以0.4 mmol/L作用60 m in后进行检测较为合适。细胞样品中ERND产物甲醛平均回收率为78.80%±4.37%,平均日内精密度为2.80%±1.40%,平均日间精密度为3.91%±1.45%,通过计算探针酶ERND活性可为鱼类细胞CYP3A活性的评价提供简便可靠的方法,从而为鱼类药物代谢酶体外诱导模型的研究奠定了基础。     

氰戊菊酯对草鱼肝微粒体CYP3A活性的影响

通过设计1.2、6.0、12.0μg/L 3个氰戊菊酯质量浓度组,1个空白对照组,1个恩诺沙星阳性对照组,进行氰戊菊酯对草鱼肝微粒体CYP3A活性影响及草鱼CYP3A活性的组织分布研究。结果表明:CYP3A存在于肝脏、鳃、肾脏、脾、肠、脑组织中,其中肝脏中活性最高;氰戊菊酯能显著抑制CYP3A的活性,随暴露时间的延长抑制作用增强,但抑制趋势减弱,3 d内趋势最强,各试验浓度组之间的差异不显著。建议临床用药,尤其是联合用药、多次用药时要充分考虑氰戊菊酯对代谢酶活性的影响。     

柴胡总皂苷调控细胞色素P450酶发挥类似柴胡疏肝散抗抑郁作用研究

目的 观察柴胡总皂苷（total saponins,TS）对肝气郁结证（liver-Qi stagnation,LQS）和肝郁脾虚证（liver stagnation and spleen deficiency,LSSD）小鼠抑郁行为的改善作用,并探讨其抗抑郁作用与CYP3A4的关系。方法 构建LQS、LSSD模型,TS干预14 d后,通过体质量测定、悬尾实验和强迫游泳实验评估小鼠抑郁样行为,并采用蛋白印迹法和逆转录定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法检测CYP3A4蛋白和mRNA的表达变化。结果 造模完成后,与空白组相比,模型组的体质量明显减轻,悬尾不动时间和强迫游泳不动时间明显增加（P<0.01）。TS干预14 d后,LQS模型小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间明显缩短（P<0.01）,LSSD模型小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间无明显变化（P>0.05）。TS可下调LSD抑郁症模型小鼠CYP3A4蛋白的表达（P<0.01）,而对其mRNA的表达影响无显著性差异（P>0.05）。结论 TS可改善LSD模型小鼠的抑郁样行为,其作用机制可能与下调CYP3A4蛋白的表达有关。     

原花青素对体外培养牛卵泡颗粒细胞增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响

【目的】探究原花青素（proanthocyanidins,PC）对体外培养的牛卵泡颗粒细胞（granulosa cells,GCs）增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响。【方法】采集性成熟荷斯坦奶牛卵巢组织,分离卵泡GCs,使用免疫荧光对其进行鉴定。用不同质量浓度（10,30,50,70和90 μg/mL）的PC对牛卵泡GCs作用不同时间（12,24和48 h）后,测定GCs存活率。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测10,50和90 μg/mL PC对牛卵泡GCs周期相关基因（CCND1和CCND2）、凋亡相关基因（caspase-3、caspase-9和Bim）以及类固醇激素合成相关基因（CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD）相对表达量的影响,并检测培养上清液中类固醇激素（雌二醇（E₂）和孕酮（P₄））的浓度。【结果】分离获得了纯度较高的牛卵泡GCs。当PC质量浓度为50 μg/mL且培养24 h时,牛卵泡GCs的存活率最高。当PC质量浓度为50 μg/mL时,牛卵泡GCs周期相关基因CCND1和CCND2相对表达量均极显著升高（P＜0.01）;凋亡相关基因caspase-3和caspase-9相对表达量均极显著降低（P＜0.01）,Bim相对表达量显著降低（P＜0.05）;E₂和P₄浓度均极显著增加（P＜0.01）;类固醇激素合成相关基因CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。当PC质量浓度为10 μg/mL时,牛卵泡GCs凋亡相关基因caspase-3的相对表达量显著降低（P＜0.05）;P₄浓度显著增加（P＜0.05）;CYP19A1和3β-HSD相对表达量均显著升高（P＜0.05）,CYP11A1和STAR相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。当PC质量浓度为90 μg/mL时,E₂浓度显著增加（P＜0.05）,P₄浓度极显著增加(P＜0.01）;CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。【结论】50 μg/mL PC通过促进牛卵泡GCs周期相关基因的表达和抑制凋亡相关基因的表达而促进牛卵泡GCs的增殖。10～90 μg/mL PC通过促进类固醇激素合成相关基因的表达而促进了牛卵泡GCs合成和分泌类固醇激素,进而影响牛卵泡GCs类固醇激素合成与分泌功能。     

不同剂型中草药抑菌水平的分析

为观察中草药提取物的体外抑菌效果,按常规法制备中草药复方A(黄芩、连翘、大黄、蒲公英)和复方B(白头翁、黄连、黄柏、秦皮)的水提取物、醇提取物,利用管碟法和试管2倍稀释法测定中草药提取物抑菌圈的大小和对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果表明,2种中草药复方对大肠杆菌均有一定的抑制作用,并且醇提物的抑菌效果均优于其水煮提取物(P<0.05)。其中复方A的醇提取物和水煮提取物的MIC分别是15.625mg/mL和31.25mg/mL;复方B的醇提取物和水煮提取物的MIC分别是31.25mg/mL和62.5mg/mL。     

速眠新对大鼠原代肝细胞CYP3A1、CYP2E1的影响

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据.     

多溴联苯醚对大鼠肝细胞CYP1A2依赖性MROD活性的影响

采用未成熟SD大鼠肝细胞微粒体为试验材料,以2,3,7,8-四氯-二苯基-并-二哑噁英(2,3,7,8- tetrachlorobenzo-p-dioxin,TCDD)作为参照,利用甲氧基-异酚噁脱甲基酶(methoxyresorufin-O- demethylase,MROD)竞争性抑制动力学和荧光光谱法分析法,测定了5种多溴联苯(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)对7-甲氧基-异酚噁唑脱甲基反应的影响,间接研究了这些PBDEs对CYP1A2 的竞争性抑制作用。结果表明,和TCDD相比,PBDEs对MROD活性的抑制作用较弱,亦即对CYP1A2的 竞争性抑制作用较弱。     

复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响

建立肉鸭aflatoxin B1（AFB1）慢性中毒模型,设立正常组、模型组、亚硒酸钠组、复方柴芩颗粒（中药）高、中、低剂量组。造模后第7,14和21天处死肉鸭取肝,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肝标本中CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性。结果表明,与模型组相比,中药高、中、低剂量组用药7和14 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性显著降低;用药21 d后CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性升高,但与模型组相比差异不明显。说明前期复方柴芩颗粒通过抑制CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性,减少AFB1前体物质代谢激活,降低其化学性肝脏损伤达到保护肝脏的作用。而用药后21 d CYP450活性升高的原因可能是AFB1蓄积较多,需要更多的CYP450代谢AFB1。     

小立碗藓细胞色素P450基因CYP73A49的克隆与功能分析

本研究克隆了一个小立碗藓（Physcomitrella patens）P450基因CYP73A49,其cDNA全长1629bp,预测编码542个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能,利用同源重组技术对CYP73A49基因实施定点突变,成功构建了能诱导其功能缺失的载体,并获得了苔藓的功能缺失突变体。     

鲫鱼肝脏微粒体ＣＹＰ４５０同工酶对多溴联苯醚胁迫的应答

以鲫鱼(Carassius aztratus Linn.)为试验鱼类,研究了其暴露于不同浓度的2,2',4,4'-四溴联苯醚(PBDE-47)和十溴联苯醚(PBDE-209)后鱼肝微粒体中CYP450同工酶活性的动态变化.结果表明,鲫鱼在0.10-5.00 mg·L~(-1)的PBDE-47和5.00～50.0 mg·L~(-1)的PBDE-209中暴露15 d后,其肝脏微粒体中CYP450系的同工酶CYP1A1被诱导,呈显著的剂量-效应关系.CYP1A1的活性随着作用时间的延续而上升,到试验第15 d时达到最高,但上升速率最快的阶段为试验后的0～5 d.而CYP450系的同工酶CYP1A2则表现出不同的特点,即低浓度PBDEs试验组对CYP1A2无显著影响(P>0.05),但5.00mg·L~(-1)PBDE-47、30.0和50.0mg·L~(-1)PBDE-209浓度组的鱼肝微粒体CYP1A2活性受到了轻微的抑制,最大抑制率分别为6.48%、3.48%和7.23%.研究表明,鱼类肝脏微粒体中CYP450的同工酶可作为污染生物标志物来评价PBDEs的早期污染毒理效应.     

转飞蝗CYP408B1和CYP409A1基因果蝇品系对杀虫剂的敏感性

【目的】细胞色素P450（Cytochrome P450）是昆虫体内广泛分布的代谢解毒酶系,飞蝗（Locusta migratoria）是重要农业害虫,揭示其体内P450代谢解毒功能对飞蝗有效治理尤为必要。研究旨在将飞蝗2个P450基因CYP408B1和CYP409A1分别转入果蝇（Drosophila melanogaster）体中,建立转基因果蝇品系,测定果蝇对杀虫剂的敏感性,为进一步探索飞蝗CYP408B1和CYP409A1对杀虫剂的代谢解毒功能提供依据。【方法】采用转基因技术成功构建转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的纯合果蝇品系;分别选择雄性转基因果蝇UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和亲本果蝇attp40与tub-gal4的处女果蝇杂交,提取子一代启动目的基因CYP408B1和CYP409A1表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1以及对照组果蝇品系tub＞attp40的DNA和总RNA,并将RNA体外反转录为cDNA。分别以DNA和cDNA为模板,PCR方法验证转基因果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;通过杀虫剂生物学测定,进一步分析转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40、UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和attp40对溴氰菊酯、马拉硫磷和毒死蜱3种杀虫剂的敏感性;采用荧光法定量测定转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40中细胞色素P450的总酶活性。【结果】PCR扩增结果显示以DNA为模板,启动目的基因表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1中均可以检测到目的条带,大小分别为1 555和1 585 bp;以cDNA为模板进行RT-PCR和RT-qPCR,结果显示在转基因果蝇品系中飞蝗CYP408B1和CYP409A1均得到表达。对3种杀虫剂的生物测定结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1对溴氰菊酯的抗药性均较对照组高,且与tub＞attp40相比,抗性比分别为1.59和1.83,而对马拉硫磷和毒死蜱的抗性比并未提高。细胞色素P450总酶活性结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1总酶活性与对照组tub＞attp40相比,均无显著性差异。【结论】利用转基因技术成功构建了转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;飞蝗CYP408B1和CYP409A1均对溴氰菊酯具有一定的解毒功能。     

根癌农杆菌介导CYP1A1转化菠萝的研究

将菠萝(Ananas comosus)愈伤组织经含有植物表达重组质粒(pUHA1-CYP1A1)的根癌农杆菌(LBA4404菌株)侵染后,在MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+100μmol/LAS+8g/Lagar上共培养3d,转入选择培养基(MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+20mg/LKm+400mg/LCarb+8g/Lagar)上培养约10d后开始分化出不定芽;28d后将绿色的抗Km不定芽转入MS+2.0mg/LNAA+30mg/LKm+300mg/LCarb+8g/Lagar上再进行连续2轮选择,随后将绿芽转入MS+1.0mg/LIBA+30mg/LKm+8g/Lagar上生根,共获得95株Km抗性植株,转化率0.12%～2.69%.对其中部分的抗Km植株进行PCR检测,PCR阳性植株率达64.29%.经Southern杂交进一步证实,CYP1A1已整合到菠萝基因中.以琼脂为培养基凝固剂、共培养基中添加AS、增加选择次数和逐渐增加新一轮选择培养基中的Km质量浓度等是根癌农杆菌介导菠萝愈伤组织获得转基因植株的重要条件.     

4种中草药提取物对水霉的体外抑菌试验

实验采用生长速率法和孢子萌发法测定了五倍子、黄连、黄芩及乌梅4种中草药的提取物对水霉菌丝及游动孢子的抑制作用。结果表明,4种中草药的提取物对水霉菌丝生长及游动孢子的萌发均有一定程度的抑制作用。其中以黄芩的乙酸乙酯提取物对水霉菌丝的生长抑制作用最显著,0.1mg/m L时抑制效率为83%,0.5mg/m L时可完全抑制水霉菌丝的生长。黄芩的乙酸乙酯及无水乙醇提取物在浓度为0.4mg/m L,可使80%的水霉游动孢子萌发被抑制。