洛克沙胂对猪肝微粒体CYP3A4及CYP2E1蛋白的影响

洛克沙胂是一种常用的饲料添加药物,细胞色素P450酶系(CYP或P450)是动物体内药物代谢的主要酶类。本文研究了洛克沙胂对猪肝微粒体P450酶系中的2种酶CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达的影响,为揭示该药的代谢机理、残留机制以及临床安全用药提供理论依据。实验将洛克沙胂以5、25和125mmol/L 3个剂量,分别添加到猪肝微粒体体外孵育体系中,以生理盐水作对照,于37℃孵育1h,测定微粒体蛋白含量及CYP3A4及2E1的蛋白表达。结果表明中剂量和高剂量的洛克沙胂对猪肝细胞微粒体的CYP3A4及2E1的蛋白表达均呈现抑制作用,而低剂量的洛克沙胂对CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达影响很小。     

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其表达水平的影响

[目的]研究辛硫磷暴露对鲫鱼肝微粒体中细胞色素P4501a(CYP1A)活性及其mRNA和蛋白表达的影响,明确其剂量—效应及时间—效应关系,为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据.[方法]设辛硫磷低、中、高浓度组(0.0825、0.165和0.33 mg/L)和丙酮(助溶剂)对照组,采用半静态染毒法染毒鲫鱼,分别于染毒24、48、72和96 h后取样并迅速剖解取出鲫鱼肝胰脏,以CYP1A相关酶7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)活性反映CYP1A活性,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达情况.[结果]辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用,辛硫磷染毒24 h时CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系;各辛硫磷浓度组间均存在明显的时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%,且差异极显著(P<0.01,下同).辛硫磷染毒后,鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势,各染毒时间组间均存在较强的剂量—效应关系,除染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关外,其他染毒时间点均呈负相关.辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平,且呈明显的剂量—效应及时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组的表达量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%.[结论]辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响,其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显.     

重组CYP3A46细胞微粒体体外药物 代谢动力学分析

通过对巴马小型猪CYP3A46 重组细胞微粒体体外药物代谢动力学特征比较分析,为巴马小型猪应用 于临床前药理试验提供科学依据。分析重组CYP3A4、CYP3A46 细胞微粒体药物代谢动力学参数Vmax、Km(S50）、 Clint 及IC50 均表明：CYP3A46 的硝苯地平、睾酮的代谢活性及酮康唑的抑制活性均比较接近CYP3A4(P>0.05）, CYP3A46 是否是CYP3A4 的同源酶需要进一步研究确定。     

氰戊菊酯对草鱼肝微粒体CYP3A活性的影响

通过设计1.2、6.0、12.0μg/L 3个氰戊菊酯质量浓度组,1个空白对照组,1个恩诺沙星阳性对照组,进行氰戊菊酯对草鱼肝微粒体CYP3A活性影响及草鱼CYP3A活性的组织分布研究。结果表明:CYP3A存在于肝脏、鳃、肾脏、脾、肠、脑组织中,其中肝脏中活性最高;氰戊菊酯能显著抑制CYP3A的活性,随暴露时间的延长抑制作用增强,但抑制趋势减弱,3 d内趋势最强,各试验浓度组之间的差异不显著。建议临床用药,尤其是联合用药、多次用药时要充分考虑氰戊菊酯对代谢酶活性的影响。     

猫眼草黄素对不同来源大鼠肝微粒体CYP450亚酶活性影响的对比研究

采用“Cocktail”探针底物法,分别以咪达唑仑、非那西丁、香豆素、奥美拉唑、氯唑沙宗、右美沙芬、甲苯磺丁脲作为CYP3A4、1A2、2A6、2C19、2E1、2D6、2C9的特异性探针底物,采用RP-HPLC-UV测定体系中底物浓度变化,比较猫眼草黄素对不同来源肝微粒体体系中(市售/自制)各亚酶活性影响及抑制类型差异。结果表明：猫眼草黄素在市售大鼠肝微粒体孵育体系中,对CYP1A2、3A4、2E1、2C19存在抑制作用,IC₅₀值分别为0.005 (CYP1A2)、0.006 (CYP2C19)、0.003 (CYP3A4)、0.028 (CYP2E1) mmol·L^-1,表明其对1A2、3A4抑制活性更强,但对3A4可能存在低浓度诱导、高浓度抑制的双重调节。抑制类型分别为非竞争性抑制和反竞争性抑制,K_i值分别为0.004 1、0.003 7 mmol·L^-1;在自制大鼠肝微粒体体外孵育体系中,药物对CYP2C9、2A6、3A4存在不同程度的抑制作用,但反而显著提高CYP2C19酶活性,且无法确...     

转飞蝗CYP408B1和CYP409A1基因果蝇品系对杀虫剂的敏感性

【目的】细胞色素P450（Cytochrome P450）是昆虫体内广泛分布的代谢解毒酶系,飞蝗（Locusta migratoria）是重要农业害虫,揭示其体内P450代谢解毒功能对飞蝗有效治理尤为必要。研究旨在将飞蝗2个P450基因CYP408B1和CYP409A1分别转入果蝇（Drosophila melanogaster）体中,建立转基因果蝇品系,测定果蝇对杀虫剂的敏感性,为进一步探索飞蝗CYP408B1和CYP409A1对杀虫剂的代谢解毒功能提供依据。【方法】采用转基因技术成功构建转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的纯合果蝇品系;分别选择雄性转基因果蝇UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和亲本果蝇attp40与tub-gal4的处女果蝇杂交,提取子一代启动目的基因CYP408B1和CYP409A1表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1以及对照组果蝇品系tub＞attp40的DNA和总RNA,并将RNA体外反转录为cDNA。分别以DNA和cDNA为模板,PCR方法验证转基因果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;通过杀虫剂生物学测定,进一步分析转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40、UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和attp40对溴氰菊酯、马拉硫磷和毒死蜱3种杀虫剂的敏感性;采用荧光法定量测定转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40中细胞色素P450的总酶活性。【结果】PCR扩增结果显示以DNA为模板,启动目的基因表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1中均可以检测到目的条带,大小分别为1 555和1 585 bp;以cDNA为模板进行RT-PCR和RT-qPCR,结果显示在转基因果蝇品系中飞蝗CYP408B1和CYP409A1均得到表达。对3种杀虫剂的生物测定结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1对溴氰菊酯的抗药性均较对照组高,且与tub＞attp40相比,抗性比分别为1.59和1.83,而对马拉硫磷和毒死蜱的抗性比并未提高。细胞色素P450总酶活性结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1总酶活性与对照组tub＞attp40相比,均无显著性差异。【结论】利用转基因技术成功构建了转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;飞蝗CYP408B1和CYP409A1均对溴氰菊酯具有一定的解毒功能。     

粘虫CYP6AE88和CYP332A1基因的鉴定和生物信息学分析

鉴定粘虫Mythimna separata CYP450家族基因,分析其序列特征并推测可能的功能,为研究粘虫杀虫剂抗性分子机制提供理论依据。以棉铃虫Helicoverpa armigera CYP6AE20v2和CYP332A1作为询问序列,通过双向Blast方法分别检索粘虫转录组中CYP6AE和CYP332AcDNA序列,通过生物信息学的方法预测基因所编码的蛋白质序列的理化性质、疏水性、跨膜区、结构域、3D结构等以及可能的功能,并采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)分析夜蛾科代表物种的CYP6AE和CYP332A亚家族序列的系统发育关系。从粘虫转录组测序数据中鉴定出CYP6AE和CYP332A两个亚家族的基因,分别命名为CYP6AE88(GenBank登录号:KU145393)和CYP332A1(GenBank登录号:KU145394)。cDNA序列分析显示,CYP6AE88和CYP332A1的全长分别为1 713bp和1 815bp,分别编码509和503个氨基酸。蛋白质序列基本性质分析显示:CYP6AE88蛋白理论相对分子质量为58.9kD,等电点是7.95;CYP332A1蛋白理论相对分子质量为58.4kD,等电点是8.03。CYP6AE88和CYP332A1分别在5-22位和5-23位氨基酸之间有一个典型的疏水性区域;分别在2~21位和2~24位氨基酸之间形成一个典型的跨膜区。两个蛋白均不存在信号肽,亚细胞定位均为细胞质。蛋白质结构域分析分析显示:两个蛋白均含P450特有的5个特征序列,并且含有多个酶结合位点。3D结构分析显示,CYP6AE88含有α螺旋的数目是18条和β折叠数目是9股,CYP332A1含有α螺旋的数目是19条和β折叠10股。CYP6AE的系统发育分析显示:粘虫CYP6AE88与(草地贪夜蛾CYP6AE43+海灰翅夜蛾CYP6AE49)聚为一支(BP=72%),然后再与棉铃虫CYP6AE20v2/50/19形成单系(BP=100%);CYP332A的聚类分析显示:粘虫CYP332A1与棉铃虫CYP332A1聚为一支,bootstrap值为100%。研究结果为进一步研究粘虫CYP6AE88和CYP332A1基因杀虫剂抗性分子机制奠定了基础。     

微囊藻毒素对鲢鱼肝脏GST和CYP7A1基因表达的影响

为探究微囊藻毒素(MC)对鲢鱼肝脏谷胱甘肽S转移酶(GST)和胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)基因表达的影响,克隆了鲢鱼肝脏GST和CYP7A1基因的部分c DNA片段,并对饲养密度为1.3×108cell/L的有毒和无毒两种铜绿微囊藻水体中第2 d、第4 d和第6 d的鲢鱼肝脏取样,通过RT-PCR与Q-PCR技术分析肝脏GST和CYP7A1基因在MC影响下不同时间点的表达情况。结果显示,有毒铜绿微囊藻水体中鲢鱼肝脏GST相对表达量在第6 d显著下降,说明GST基因在第6 d时在MC解毒过程中开始发挥作用;鲢鱼CYP7A1相对表达量自第2 d开始显著下调并随时间延续维持在一个较低的水平,说明MC作用下CYP7A1表达受到抑制,可能对胆汁酸合成造成影响。为进一步研究鱼类微囊藻毒素去毒基因以及抑制对MC转运和吸收的关键基因提供依据。     

CYP1A1基因MspI多态性与卵巢癌易感性关系的研究

目的探讨张家口地区卵巢癌易感性与CYP1A1基因MspI位点多态性的关系。方法研究采用PCR-RFLP技术,将张家口地区34例卵巢癌患者作为实验组,45例健康女性人群作为对照组,分析CYP1A1基因3′端限制性内切酶MspI位点基因的基因多态性。结果卵巢癌组MspI基因型分布为:基因型TT占21.8%;基因型TC占52.7%;基因型CC占25.5%;等位基因T、C分别为48.2%、51.8%。健康人群组MspI基因型分布为,基因型TT占42.2%;基因型TC占46.7%;基因型CC占11.1%;等位基因T、C分别为65.6%、34.4%。结论该地区健康人群组和卵巢癌组CYP1A1基因MspI位点均呈多态性分布,两者之间差异有显著性(P<0.05),提示卵巢癌发病率可能与CYP1A1基因型有关。     

CYP1A1基因MspⅠ多态性与卵巢癌易感性关系的研究

目的探讨张家口地区卵巢癌易感性与CYP1A1基因MspⅠ位点多态性的关系。方法研究采用PCR-RFLP技术,将张家口地区34例卵巢癌患者作为实验组,45例健康女性人群作为对照组,分析CYP1A1基因3’端限制性内切酶MspⅠ位点基因的基因多态性。结果卵巢癌组MspⅠ基因型分布为：基因型TT占21．8％;基因型TC占52．7％;基因型CC占25．5％;等位基因T、C分别为48．2％、51．8％。健康人群组MspⅠ基因型分布为,基因型TT占42．2％;基因型TC占46．7％;基因型CC占11．1％;等位基因T、C分别为65．6％、34．4％。结论该地区健康人群组和卵巢癌组CYP1A1基因MspⅠ位点均呈多态性分布,两者之间差异有显著性（P〈0．05）,提示卵巢癌发病率可能与CYP1A1基因型有关。     

基于I-FABP的鲫肠道通透性检测方法的建立

肠道通透性与肠道稳态及个体健康状况直接相关,目前尚缺乏鱼类肠道通透性的定量评价方法及试剂。血清中肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein,I-FABP）是肠道通透性的重要血清生物学指标,可用于肠道通透性的定量评价。为建立鲫（Carassius auratus）血清I-FABP的定量检测方法,克隆了鲫I-FABP基因,经原核表达和纯化,并利用重组蛋白分别免疫新西兰白兔（New Zealand white rabbit）及小鼠（Mus musculus）,制备了兔源及鼠源多克隆抗体,其效价均为1∶80 000。以纯化的兔源多克隆抗体作为包被蛋白,以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的鼠源多克隆抗体作为酶标抗体,通过优化各反应条件建立了基于鲫I-FABP的双抗体夹心酶联免疫检测方法（double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）。标准曲线的线性回归方程为y=0.003 5x+0.036 7,拟合度较高R²为 0.999 1,临界值为0.090 6。批内及批间变异系数分别为1.17%～5.50%及0.16%～4.78%,具有较好的重复性。以该方法对54份样品进行检测,与商业化试剂盒对比,符合率为100%。构建的DAS-ELISA检测方法可用于鲫肠道通透性的定量评估。鉴于鱼类I-FABP的保守性,该方法或可用于其他鱼类肠道通透性的定量评价。     

三种复方中药对鲫鱼肝脏抗氧化功能的影响

采用三种复方中药(编号分别为AB、CD和AH)分别饲喂1龄鲫鱼28 d,同时设置空白对照组,以探讨所用方剂对鲫鱼肝脏中抗氧化功能的影响。试验期间水温20℃,每天按照体重的2.0%投喂制备的饲料。采集鲫鱼肝脏,检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)四个代表性抗氧化指标。结果表明,三种复方中药组SOD活性均显著高于对照组。MDA含量均低于对照组,其中AB、CD组与对照组差异显著(P<0.05)。GSH-PX活性均高于对照组,其中AH、CD组与对照组差异显著(P<0.05)。三种复方中药均能提高T-AOC,其中AB、CD组提高效果显著(P<0.05)。所选的三种复方中药均对鲫鱼肝脏抗氧化能力有促进作用,其中CD组方效果最好。     

速眠新对大鼠原代肝细胞CYP3A1、CYP2E1的影响

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据.     

黑龙江银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)精子生物学研究

测量了黑龙江水域比较有代表性的两个银鲫种群——方正银鲫和扎龙湖银鲫的染色体数量和精子密度 ,以及精子在天然水体中的泳动能力、精子的寿命、精子头部的直径和体积 ,结果表明 ,两种银鲫的遗传基础截然不同 ,方正银鲫的体细胞具有 15 0±条染色体 ,扎龙湖银鲫的体细胞具有 10 0条染色体 ;其精子的直径、体积和精子密度也反映了这一点 ,方正银鲫精子头部的直径平均为 2 .81︼m,体积平均为 11.83︼m3,尾长为 4 5 .2 6 ︼m;扎龙湖银鲫精子头部直径平均为 2 .34︼m,体积平均为 6 .83︼m3,尾长为 38.39︼m;方正银鲫的精子密度为 0 .5 7× 10 1 0 / m L～ 0 .90× 10 1 0 / m L,平均为 0 .73× 10 1 0 / m L;扎龙湖银鲫为 0 .94× 10 1 0 / m L～ 1.70× 10 1 0 / m L,平均为 1.38× 10 1 0 / m L。其他测量内容没有明显的区别 ,方正银鲫和扎龙湖银鲫精子的泳动能力分别为 4 9.16 s和 4 9.15 s,寿命分别为 3min2 4 s和 3m in16 s,两个群体之间的差异不显著 (P >0 .0 5 )。两种鲫鱼的授精力没有明显的区域。本项研究进一步证明方正县双丰水库具有 15 0±条染色体的银鲫 ,其雄性具有正常的性别发育和生产精液的能力 ,所产生的精子与倍性正常的鱼类的精子在形态结构、泳动能力和受精能力等方面没有明显的区别?     

短时间微流水处理对异育银鲫肌肉品质的影响

采用微流水系统处理池塘养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio),测定不同处理时间(0～9 d)鲫肌肉的主要营养成分、滋味特征、气味特征和挥发性成分等参数,研究微流水处理对鲫肌肉品质的提升作用。结果显示,微流水处理对养殖鲫肌肉中水分、粗蛋白和粗脂肪含量的影响不大(P0.05),但对鱼肉中灰分、肌糖原和总糖含量及滋味、气味及感官评分有显著影响(P0.05)。随着微流水处理时间延长,鲫鱼肉中肌糖原、总糖含量显著下降,灰分明显增加(P0.05)。电子舌和电子鼻检测结果显示,微流水处理可显著改变鲫肌肉的滋味特征、气味特征。随着微流水处理时间延长,鲫肌肉中异味挥发物含量明显减少、鱼肉自身代表性风味物质含量明显增加,且蒸熟后鱼肉的气味、滋味、质地和总分等评分明显升高,微流水处理7 d的鲫肌肉的感官评分优于0、1、3、5 d样品的,而与微流水处理9 d的样品无差异。综上可见,短时间微流水处理(≤7 d)不影响鲫鱼肉中粗蛋白和粗脂肪含量,但可显著改善养殖鲫肌肉品质,其适宜处理时间为7 d。     

水蕹菜浮床覆盖度对淇河鲫的生长及营养品质的影响

为了获得淇河鲫池塘养殖中的最佳水蕹菜浮床覆盖度,试验随机选取360尾淇河鲫,设计水蕹菜浮床覆盖度为0%(C0)、10%(C1)、20%(C2)和30%(C3)4个试验组,每组3个重复,每个重复30尾鱼,饲养90 d后,测定各试验组养殖水质、淇河鲫的生长、常规营养成分和氨基酸含量,并比较其差异。结果显示,水蕹菜浮床覆盖度仅对鱼肉品质中的甘氨酸、缬氨酸和精氨酸有显著性影响（P<0.05）,3种氨基酸的最大值基本上在C1试验组,且各试验组间缬氨酸和精氨酸的含量变化与增重率变化一致。此外,与C0相比,C1、C2和C3试验组均含有较高的粗蛋白和灰分含量及较低的粗脂肪含量,其中C1试验组具有最高的粗蛋白含量和最低的粗脂肪含量。结果表明,10%水蕹菜浮床覆盖度最有利于淇河鲫的优良鱼肉品质的形成,过高的覆盖度则起相反作用。     

鲫鱼淋巴细胞转化PHA刺激剂量及流式细胞仪检测参数探讨

从异育银鲫外周血中分离淋巴细胞,利用RPM I-1640培养基培养48 h后,采用流式细胞仪分析方法研究不同浓度的植物凝集素(phytohem agglutin in,PHA)(0μg/mL、80μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL、1 200μg/mL)对外周血淋巴细胞转化率的影响,旨在探索异育银鲫外周血淋巴细胞体外转化最适刺激剂量。结果表明:(1)在PHA浓度0~400μg/mL的范围内,随着PHA浓度的增加,淋巴细胞转化率也增加,呈浓度依赖的关系,但当PHA的浓度增加到1 200μg/mL,淋巴细胞转化率明显下降。其中PHA浓度为400μg/mL时,淋巴细胞转化率最高,显著高于低浓度组(80μg/mL)和高浓度组(1000μg/mL、1200μg/mL)(P<0.05),略高于中浓度组(200μg/mL、600μg/mL、800μg/mL),差异不显著(P>0.05)。由此可见,在本试验条件下,PHA体外刺激异育银鲫淋巴细胞转化的最适剂量为400μg/mL。(2)用流式细胞仪检测细胞内DNA合成情况,Mu lticyc le AV软件进...