酿酒酵母的乳酸抗性机制

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)乳酸抗性单倍体突变株T-27-24(αtrp-ura-)和其亲株T-27(αtrp-ura-)为研究对象,考察于30℃在5%(V/V,下同)乳酸冲击条件下菌体存活率、细胞膜通透性以及菌体积累海藻糖和麦角固醇等方面的情况。结果表明,在5%乳酸冲击下,T-27-24菌体存活率明显高于T-27,且比T-27具有较强的降低细胞受冲击时细胞膜通透性的作用;同时T-27-24对海藻糖和麦角固醇的积累能力都明显高于T-27。因此,T-27-24具有较强的维持细胞膜完整性和积累海藻糖及麦角固醇的能力,这是其具有乳酸抗性的重要原因。     

高产酿酒酵母SCY6生长与发酵条件的优化

采用高产酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SCY6发酵葡萄糖产乙醇,设计单因素试验考察该酵母菌株适宜的生长条件,采用正交试验优化酵母发酵产乙醇的条件.结果表明,该酵母菌株的最适生长温度和pH分别为28℃、5.0,培养基中葡萄糖质量分数为15％时其生长状态较好.正交试验结果表明,最适合该酿酒酵母发酵产乙醇的条件为玉米浆和(NH4)2SO4作为氮源,用量分别为20 g/L和2 g/L,接种量为4％,pH 5.0.在此条件下进行发酵,发酵液中乙醇体积分数可达7.77％,葡萄糖转化率达83.82％.     

耐高温酿酒酵母木薯乙醇发酵条件的优化

通过单因素试验和正交试验,对耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG-1的木薯乙醇发酵的主要影响因素进行了研究.结果表明,在40℃高温培养条件下,XG-1对乙醇更加敏感,影响其木薯乙醇发酵,而影响木薯乙醇发酵各因素的主次顺序为发酵温度＞接种量=发酵时间.木薯乙醇发酵最佳工艺条件为发酵液中木薯淀粉含量200 g/L,氮素[(NH4)2SO4]添加量8 g/L,XG-1接种量约1.0×107CFU/mL,发酵温度33℃,发酵时间72h,发酵结束时发酵液中乙醇体积分教为13.1％,淀粉利用率为92.0％.     

基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

利用引物探针序列构建转基因马铃薯检测阳性重组质粒及其验证

[目的]通过将特定转基因检测方法引物和探针序列重组拼接,并将重组序列连接至质粒中,验证其作为转基因检测阳性对照的可行性。[方法]通过搭桥PCR和全基因合成的方法制备阳性重组序列,验证阳性重组序列作为阳性对照品的可行性与阳性重组质粒的均一性、稳定性。[结果]通过将引物探针序列顺序拼接构建得到的阳性重组质粒的性状均一,在4和-20℃条件下均能稳定产生阳性结果。[结论]该种阳性重组质粒的构建方法能够满足转基因成分检测方法中阳性对照品的要求。     

快速鉴定阳性重组质粒方法的改进试验

利用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)直接裂解细菌菌液,通过电泳与空质粒DNA载体进行比较,探讨了一种快速鉴定重组质粒的简单方法。该方法在细菌菌落快速裂解法的基础上进行了改进,既保留了细菌菌落快速裂解法简单方便、成本低廉的优点,同时又克服了细菌菌落裂解法因菌落大小有限以及裂解液粘度大、易于被带出点样孔,致使有时产生假阴性现象的不足,利用该方法鉴定cDNA文库质量时,可以克服菌落较小的限制。     

蜂毒前溶血肽原重组质粒pET 28a( + ) PPMel的构建及分析

为了探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,对重组质粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因进行了更换载体处理,并重新构建了蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMel,为进一步转化大肠杆菌感受态细胞并进行蜂毒前溶血肽原基因的表达提供了材料。相关序列的生物信息学分析表明,新的重组质粒可表达含有106个氨基酸残基的融合蛋白,其中包括His标签。该融合蛋白没有信号肽序列,但存在跨膜区域,其在大肠杆菌中的表达需进一步探讨。     

Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。     

离子液体[BMIM]Cl对酿酒酵母生长及其乙醛脱氢酶活性的影响

设置单因素试验考察不同浓度离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.399生长及其乙醛脱氢酶活性的影响.结果表明,[BMIM]Cl对酵母的生长有抑制作用,且其浓度越高,抑制作用越明显;低浓度的[BMIM]Cl可以提高酵母乙醛脱氢酶的活性,高浓度则会抑制其活性.     

Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因重组表达质粒的构建。利用来自重组质粒pLmleA的，mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件。以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS—PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中。获得的转化子在添加了L-苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L-苹果酸及L-乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L-苹果酸转化成L-乳酸，L-苹果酸和L-乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，L-乳酸的生成量为1002—1106mg／L。苹果酸的相对降低率为19．16—22．34％。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

新城疫病毒HN基因片段原核表达重组质粒的构建

根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp.将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中,经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达栽体pET-28a,PCR和酶切鉴定表明,克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中.     

利用微卫星多态性揭示酿酒酵母菌株遗传多样性

【目的】利用微卫星标记技术对来自新疆和宁夏的48株酿酒酵母菌株进行区分,并分析其亲缘关系。【方法】选择4个微卫星位点：SCAAT1、SCYOR267c、C11和YPL009c,用其多态性对48个菌株进行分析。【结果】4个微卫星标记在48株菌中共检测到87个等位基因,39种基因型;4个位点多态信息含量为0.8593-0.9115,均为高度多态位点;期望杂合度（heterozygosity expected, He）和观测杂合度（heterozygosity observed, Ho）分别为0.8803-0.9268和0.8333-0.9792。【结论】宁夏和新疆地区酿酒酵母菌株生物多样性丰富。     

基因敲除GCV2的酿酒酵母构建

[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。     

转鲑鱼降钙素基因酵母对体外培养破骨细胞的影响

用机械分离的方法获得新生Wistar大鼠的破骨细胞,在培养液中分别加入经肠激酶酶切的转鲑鱼降钙素基因酵母的上清液和密钙息（Miacalcic,鲑鱼降钙素注射液）,以HE染色观察破骨细胞形态,Image-Pro Plus图像软件分析骨片上骨吸收陷窝的面积,骨片培养7天,吸收陷窝结果显示,转鲑鱼降钙素对破骨细胞吸收功能具有明显的抑制作用。     

富钼酿酒酵母菌株的选育及其生物学功能研究

以酿酒酵母单倍体菌株SY10作为出发菌株,采用紫外线、微波复合诱变处理其原生质体,选育出1株对钼高抗性突变株SY10-186-8,其抗性水平为400 mmol/L,是出发菌株的5.71倍。生物学功能结果表明,与出发菌株相比,该突变株拮抗紫外线、清除羟基自由基和超氧自由基能力以及黄嘌呤氧化酶活性均显著增强。经50世代培养,该突变菌株遗传稳定性良好,达90%以上。     

重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定

干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,在其两端分别添加Bam H I与Spe I酶切位点并进行人工合成,然后经双酶切后与p1301植物表达载体连接,构建重组表达载体p1301-Cm Tre1*。PCR、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体p1301-Cm Tre1*构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。用含有p1301-Cm Tre1*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得26株阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的mRNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟Cm Tre1基因起到明显的沉默作用。