光皮桦LFY同源基因的克隆及表达分析

以珍贵用材树种光皮桦（Betula luminifera）为材料,采用同源克隆与RACE的方法,克隆获得LFY同源基因,命名为BlLFY（GenBank号：KP970616）。BlLFY基因cDNA全长1 305 bp,开放阅读框（ORF）长1 212 bp,编码403个氨基酸。基因结构分析显示,BlLFY基因具有2个内含子和3个外显子,与其它植物同源基因具有一致的基因结构。多序列比对和系统进化分析表明,BlLFY基因编码蛋白具有典型的N-domain和C-domain,与板栗（Castanea mollissima）及核桃（Juglans regia）等木本植物的LFY具有最高的同源性和进化关系。进一步的表达模式分析结果表明,BlLFY基因在光皮桦植株进入成年期时表达水平最高,在开花植株的营养器官和生殖器官中均有表达,且贯穿雌、雄花序发育的整个过程,但在雌花序中的表达明显高于雄花序,说明BlLFY基因可能与花期转换和花器官的发育有关,但在雌、雄花序发育过程中的调控作用可能不同。     

草莓LFY 同源基因的克隆及其表达分析

 以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材,通过PCR和RACE的方法克隆出LFY同源基因的cDNA全长序列,命名为FaLFY（GenBank收录号JN788260）,通过定量PCR的方法检测了该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明FaLFY编码区长度为1 236 bp,编码412个氨基酸,与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与蔷薇科玫瑰的LEAFY-1同源性最高,达到88%。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、不同的花器官中FaLFY的表达量存在差异,其中在花芽中的表达量最高,在营养生长的组织中基本不表达,在成熟花器官中同样不表达,说明该基因在草莓的成花进程中发挥重要作用。     

沙田柚RNase-like基因的克隆及序列分析

以沙田柚自交和异交花柱为试材,采用高通量测序技术对其进行转录组测序。通过差异分析得到RNase-like贮藏蛋白的基因序列,并研究了其理化性质。结果表明:该基因全长1 048bp(GenBank登录号为KR363153),开放阅读框(ORF)全长为693bp,共编码230个氨基酸,编码的蛋白质的分子量为25.82kDa,理论等电点为5.30,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2超家族成员。该蛋白为疏水性蛋白,可能的磷酸化位点共有15个。氨基酸序列同源性分析表明,该基因编码的氨基酸与甜橙和克莱门柚的同源性均为99%。系统进化树显示沙田柚RNase-like贮藏蛋白基因与甜橙,克莱门柚的亲缘关系较近,属于同一进化分支。     

甘蓝BoPID基因的克隆与分析

在通过酵母双杂交文库获得了与钙响应蛋白BoSPx相互作用蛋白BoPID的基础上,对BoPID的编码基因进行了克隆、时空特异性表达分析及筛选与其互作的蛋白,以期为BoSPx通过BoPID参与自交不亲和性分子过程提供依据.结果表明,BoPID包含2个外显子和1个内含子,编码439个氨基酸.激酶磷酸化预测分析显示具有激酶活性...     

桂花SVP同源基因的克隆及序列分析

试验以桂花‘日香桂'Osmanthus fragrans cv.rixianggui嫩叶为试验材料,根据转录组数据库中SVP基因的保守序列信息,通过PCR方法克隆得到日香桂SVP基因,将其命名为QfSVP,运用在线生物信息学分析工具对OfSVP序列进行分析。结果表明:OfSVP基因全长1325bp,开放阅读框(ORF)为687bp,编码228个氨基酸。氨基酸序列保守性分析发现,OfSVP所编码的蛋白中含有MADS-box基因家族特有的K-box区域。通过ProtParam ExPASy在线软件分析OfSVP蛋白质分子式为C1121H1859N327O364S9,分子量为26030.60Da,理论等电点PI值为5.80。不稳定指数为68.10,属于不稳定蛋白质。蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明OfSVP与油橄榄(Olea europaea)、黄连(Coptis chinensis)和芝麻(Sesamum indicum)的同源性分别达到94%、83%和82%;OfSVP基因的克隆与序列分析对于进一步了解桂花'日香桂'成花机理具有重要意义。     

梅PGIP基因的克隆及全序列分析

 通过PCR扩增, 从梅基因组中得到1条全长1 192 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白( PGIP)基因序列。该序列包含有1个完整的开放阅读框和1个内元。比对结果表明, 克隆到的序列与桃、马哈利樱桃中相应序列一致度分别为96%和95% , 其蛋白质序列与桃、马哈利樱桃的蛋白质序列一致度分别为97%和94%。该蛋白质序列中包含着一段亮氨酸重复序列。     

甘蓝BYPASS1 编码基因的克隆与表达分析

通过双向电泳结合MALDI-TOF-TOF/MS 质谱技术在甘蓝柱头内鉴定出1 个受自花授粉诱导
上调表达的BYPASS1 蛋白（BPS1）。利用PCR 技术扩增甘蓝BPS1 基因的编码序列, 序列分析结果表明：
该基因没有内含子,开放阅读框为1 059 bp,编码352 个氨基酸,蛋白质分子量为38.7 kD。氨基酸同源
性和系统发生树分析结果表明：甘蓝BPS1 与拟南芥BPS1 亲缘最近,氨基酸同源相似性达85%;与烟草
BPS2 关系较远。RT-PCR 检测结果表明：甘蓝BPS1 基因在开花前1～2 d 的花瓣、萼片、花药、柱头和
叶片中均有表达,柱头中的表达量最高。实时荧光 定量PCR 分析结果表明：甘蓝柱头内BPS1 表达水平在
自花授粉后逐渐升高,异花授粉后柱头内BPS1 表达水平先升高后降低再升高。     

柑橘及其近缘属植物LFY同源基因的比较

LFY基因处于成花调控网络的关键位置,不仅调控开花时间和花转变,而且在花序和花的发育中也起重要作用。为了进一步探讨柑橘及其近缘属植物开花的分子机理,利用PCR技术分别从兴津温州蜜柑(Citrus unshiuMarcovitch)、无核椪柑(Citrus reticulata Blanco)、沙田柚[Citrus grandis(L.)Osbeck]、融安金柑(Fortunella crassifoliaSwing)和无核黄皮[Clausena lansium(Lour.)Skeels]叶片中分离克隆了LFY全长同源基因。结果表明兴津温州蜜柑、无核椪柑、沙田柚、融安金柑和无核黄皮中的LFY全长同源基因的核苷酸长度分别为2090、2086、2092、2081、2089bp,分别编码398、398、398、398和397个氨基酸,这些同源基因均由3个外显子和2个内含子组成。同源性分析发现,这些LFY全长同源基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性高,分别为92%～99%和95%～100%。亲缘关系分析结果与当前的植物学分类结果一致。     

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。     

黄瓜CsPAP-fib基因的克隆与序列分析

以温敏型黄瓜‘C09-123’为试材,通过对不同夜温处理的黄瓜幼叶进行差异蛋白质鉴定,筛选出一个与低夜温影响黄瓜雌性形成密切相关的蛋白,采用生物信息学方法,对该蛋白进行生物信息学分析,并运用基因克隆技术克隆了该基因,以期为明确该基因在黄瓜性别分化中的作用机制奠定基础,也为进一步试验研究提供基因材料。结果表明:该基因全长870bp,编码289个氨基酸,该基因编码的蛋白质属于叶绿体中一个不稳定的疏水蛋白质,无明显信号肽,无跨膜结构。与甜瓜为同一进化分支,同源性较高。该蛋白属于PAPfibrillin蛋白家族,因此将编码该蛋白的基因命名为CsPAP-fib。     

结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的检测

 S位点受体激酶(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)分别为甘蓝自交不亲和(self-incompatibility, SI)信号传导的雌雄决定因子。为了深入研究两者的作用机理和进行人工调控,本研究以结球甘蓝ZQ为材料,利用pET·NusA融合蛋白表达系统,将包含SRK胞外域和跨膜域的mSRK蛋白和SCR蛋白在大肠杆菌BL21中融合表达,经SDS-PAGE电泳检测表达出融合蛋白大小分别约为116 kD和74 kD。进一步将两融合蛋白进行体外相互作用的检测,结果表明mSRK与SCR蛋白能够相互结合形成稳定的复合体,这为下一步实现SRK-SCR复合体聚合与解离的人为调控提供了技术平台。     

结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析

分别以自花授粉30 min、异花授粉30 min和未授粉处理的甘蓝柱头进行Illumina HiSeq2000高通量转录组测序,分析自交不亲和性甘蓝自花授粉、异花授粉柱头与未授粉柱头中基因表达的差异。转录组测序共获得1.6 × 108对原始序列读取片段,总碱基数为2.38 × 1010 bp,与未授粉对照相比,自花、异花授粉后差异表达的基因分别有2 900个和2 328个,共有的差异表达基因1 904个。在差异表达基因背景和全部基因背景下,自花授粉较大比例的差异基因是细胞杀伤、胞外基质部分和核酸结合转录因子活性;异花授粉较大比例的差异基因是信号传递、胞外区域部分、结构分子活性和营养库活性。GO功能的显著性富集分析表明,自花授粉处理后特有的40个极显著的富集条目主要涉及糖跨膜转运活性、微管结合和钙调素依赖性蛋白激酶活性等。异花授粉特有的53个极显著的富集条目主要涉及法尼酸O–甲基转移酶的活性、微管负向运动和生长素跨膜运输等。自花授粉处理后特异差异表达的996个基因主要涉及钙离子结合、细胞骨架相关、茉莉酸和水杨酸代谢等生物过程,异花授粉处理后特异差异表达的424个基因主要涉及物质跨膜转运及脂质代谢。     

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸- 4 - 羟化酶基因的克隆及分析

 以羽衣甘蓝为材料, 克隆了全长2 431 bp的肉桂酸- 4 - 羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子, mRNA为1 715 bp, 编码一个481个氨基酸的推导蛋白, 与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序, 如血红素结合域、E - R - R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H /CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序( SRSs) 和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C₂₂₄₂单碱基缺失和相应移码, 导致其蛋白C - 末端缺失/变异了36个残基, SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失, 因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白, 可能定位于内质网, 其二级结构主要为α - 螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。     

RAPD标记构建芥蓝×甘蓝分子标记连锁图

 以芥蓝C_100-12×甘蓝秋_50-Y7为杂交组合, 构建了F₂ 作图群体, 利用300 个随机引物对两亲本进行了RAPD 检测, 共筛选到150 个RAPD 引物在亲本间表现多态, 多态引物的比率为58. 3 %。共分析了52个引物产生的96 个多态性RAPD 标记在该群体中的遗传。96 个RAPD 标记中有94 个在F2 群体中的分离比符合3∶1 , 说明该群体适合于QTL 分析, 共发现两对共分离的RAPD 标记。利用该作图群体构建了甘蓝的基本遗传图谱。该图谱由9 个主要的连锁图构成, 覆盖基因总长度约为555. 7 cM。     

结球甘蓝CML家族基因及其在授粉后柱头中的表达

利用NCBI和甘蓝基因组数据库筛选获得了76个结球甘蓝CML家族基因,其随机分布在甘蓝的9条染色体上,染色体上最多的有12个基因,最少有1个基因。分析发现该基因家族编码蛋白氨基酸残基长度在109 ~ 365个之间,分子量大多在20 kD左右,为小分子蛋白,且均含有2 ~ 4个保守的EF-hand结构域。甘蓝的76个CML基因依据与拟南芥的CML家族的进化关系及序列相似性分为Ⅰ~ Ⅷ个亚家族,每个亚家族基因有较高的同源性,进化关系较近。经亚细胞预测分析发现大部分蛋白在质膜和胞外表达,少量在质膜、细胞核内和叶绿体等部位表达。数字表达谱分析发现在76个基因中,有25个基因在自花和异花授粉后差异表达,其中BoCML12、BoCML42、BoCML44、BoCML45、BoCML60、BoCML70、BoCML71 和BoCML74等8个基因在自花和异花授粉后表达趋势有较大差异,表明这8个基因以不同的方式参与调控甘蓝自花和异花授粉后的反应过程,有可能与甘蓝的自交不亲和性相关。     

甘蓝显性雄性不育系的选育及其利用

从甘蓝原始材料７９－３９９的自然群体中获得雄性不育突变株７９－３９９－３。研究结果表明，该突变株的雄性不育受一显性不育基因ＣＤＭｓ３９９－３控制。该基因在不同的遗传背景下表现为环境敏感和环境稳定两种类型，且温度是影响不育稳定性的主要因素。环境敏感的显性雄性不育植株通过自交可以得到显性纯合的雄性不育植株。显性纯合不育植株与普通自交系或相应的姊妹系杂交获得了不育株率达到１００％、不育度达到或接近１００％的不育群体。根据ＣＤＭｓ３９９－３基因的这一遗传特点，建立了利用显性雄性不育基因配制甘蓝杂交种的新方法：利用组织培养技术保存和繁殖显性纯合雄性不育材料，然后与遗传差异较小的普通自交系或姊妹系杂交得到不育系。选择园艺性状优良、不育性稳定的不育群体作不育系，与配合力优良的自交系杂交，配制出了优良的杂交组合。试验采种结果表明，携带ＣＤＭｓ３９９－３基因的甘蓝雄性不育系结实性状优良     

芥蓝×甘蓝的F2群体抽薹期性状QTLs的RAPD标记

 利用芥蓝C1 12×甘蓝秋缸Ⅵ杂交组合的F2作图群体的RAPD标记连锁图进行了19个农艺学性状的QTL定位研究，在9个连锁群上共定位了28个QTL位点。其中控制抽薹期、开花期、株高(4月27日调查)的QTL各3个；控制伸展度、株高(4月20日调查)、叶柄长QTL各2个；控制茎高、叶数、叶宽(4月27日调查)的QTL各1个；控制叶宽(5月11日调查)的QTL有5个。     

一个结球甘蓝DH群体主要农艺性状的遗传效应分析

 采用游离小孢子培养方法,构建了一个甘蓝F₁（624×24-5）的DH群体,利用该DH群体重复试验数据建立了结球甘蓝主要农艺性状的数量性状主基因＋多基因混合遗传模型,分析了结球甘蓝8个主要农艺性状的遗传效应。结果表明,除开展度没有主基因只有多基因存在外,其余7个性状均符合2对主基因＋多基因遗传模型。其中,数量性状主基因的遗传率中最高的是最大外叶柄长,为90.44%,最大外叶宽次之,为67.22%;外短缩茎长和中心柱长的主基因遗传率较高,分别为58.62%和56%;叶球高主基因遗传率最低,为20.30%,其次为最大外叶长和株高,分别为23.32%和31.74%;多基因遗传率中最高的是叶球高度,为49.80%;开展度环境效应方差占总表现型方差的81.35%,受环境影响最大,而外叶柄长的环境效应方差只占总表现型方差的9.56%,受环境影响最小。